动物基因工程

动物基因工程动物基因工程第1页

动物基因工程是利用DNA重组技术对动物所进行工程操作。从遗传学角度分为：遗传性动物基因工程：外源基因能够经过配子进行垂直传递并稳定遗传。非遗传性动物基因工程：转基因仅在当代表现，不能够遗传给子代。动物基因工程第2页第一节动物基因工程发展情况与趋势动物基因工程实质是改变动物遗传组成，增加动物遗传多样性，赋予转基因动物新表型特征，使能够更加好地服务与人类社会。动物基因工程第3页动物基因工程第4页世界首只转基因灵长类动物

——-安迪世界第一只转基因动物动物基因工程第5页动物基因工程第6页HBV转基因动物树鼩动物基因工程第7页

从转基因技术伎俩来看，除DNA显微注射法外，大家先后试过反转录病毒载体介导法、精子介导法、胚胎干细胞介导法和核移植法等各种转基因方法。

转基因细胞核移植技术已经成为转基因动物生产主流方法。1、从简单显微注射法向高效率转基因体细胞核移植方向发展

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转基因在基因组中存在方式有两种，即随机整合和定点整合。为了到达外源基因高效表示，在转基因结构上增加了含有位点控制区（LCR）、核基质附着区(MAR)等调控元件，能够实现插入位点非依赖性、拷贝数相关表示模式。LCR和MAR功效不受种属差异限制，不论外源基因插入什么位点，都能够维持一个开放染色体结构，有利于基因表示。基因打靶技术出现与发展，实现了对目标基因定位操作。2、从外源基因随机插入（或整合）到定点整合转变

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从转基因策略来看，动物转基因技术发展经历了两个阶段：第一阶段为传统转基因动物阶段，第二阶段为条件性转基因动物阶段。借助转基因技术可将单一功效基因和基因簇引入高等动物基因组，或将目标基因从动物基因组中敲除，实现了种系内和种系间基因转移或修饰，产生新基因型和表型。当前转基因动物主要应用在生物学基础研究、医学疾病模型、动物生物反应器、异种器官移植、动物遗传改良等５个方面。３、从传统转基因到条件控制转变动物基因工程第10页

第二节转基因动物技术一、动物基因工程载体二、基因转移技术动物基因工程第11页一、动物基因工程载体作为动物基因工程载体必须具备以下几个功效：

为外源基因提供进入受体细胞转移能力为外源基因提供在受体细胞内复制或整合能力为外源基因提供在受体细胞内扩增和表示能力动物基因工程第12页动物基因工程载体质粒型表示载体病毒载体定向打靶载体动物基因工程第13页1.质粒型表示载体表示载体共同特点是都带有原核复制区和选择性标识基因，确保重组DNA分子能够在大肠杆菌中扩增，同时也必须包含能在真核细胞表示相关组件。普通包含转录外源DNA序列开启元件、转录产物有效地加上poly（A）尾巴所必需信号序列、真核细胞中选择性标识，另外还增加了一些附加元件，如增强子、内含子、剪接供体与受点，以确保外源基因高效表示。动物基因工程第14页以山羊乳腺特征表示载体pBC1为例动物基因工程第15页2.病毒载体作为基因转移病毒载体须具备以下基础条件：携带外源基因并能够包装成病毒颗粒介导外源基因转移与表示对机体不致病动物基因工程第16页（1）腺病毒（adenovirus）

腺病毒作为转染载体有许多特点：基因组重排率低外源基因与病毒DNA重组后能遗传几个周期安全性好，不会整合到人染色体上，不造成肿瘤发生宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂期要求不高外源基因在载体上轻易高效表示动物基因工程第17页（2）腺相关病毒（adeno-associatedvirus,AAV）腺相关病毒是一个天然复制缺点型非致病性单链DNA病毒，其复制需要有辅助病毒共转染。无共转染时，野生型AAV优先（70%）整合在人染色体19q13.3位点处，潜伏存在直至被辅助病毒拯救出来。其整合需要基因组两端ITR，以及非结构基因编码蛋白Rep78和Rep68存在。

动物基因工程第18页AAV含有以下几个方面特点：非致病性、无免疫原性和无炎症反应能感染静止期细胞，如神经元细胞插入外源基因表示时间长，普通能够到达1年之多宿主范围广热稳定性强，轻易经过灭活辅助腺病毒纯化动物基因工程第19页（3）反转录病毒反转录病毒是一个整合型单链RNA病毒，感染宿主细胞后，病毒颗粒中pol基因表示出反转录酶，以单链RNA基因组为模板，马上转录出一份线形双链DNA复本，然后在整合酶（Int）介导下，整合到宿主基因组内，此时整和病毒序列被称为前病毒。反转录病毒基因组整合到宿主细胞基因组后，其DNA随宿主DNA复制而复制，并由5`-LTR中一个强开启子转录出病毒RNA链，它既是病毒基因组，同时又含有mRNA模板活性，翻译出结构蛋白和反转录酶。在宿主细胞质中，两条相同RNA链和反转录酶被包装与内壳中，形成成熟病毒颗粒以芽植方式分泌至细胞外，但通常不致死宿主细胞。动物基因工程第20页3.定向打靶载体基因打靶是经过外源基因与靶细胞染色体上同源序列间同源重组，将外源基因定点整合到靶细胞特定位置上，而使某一个特定位点上基因发生定点突变技术。在细胞内存在两条相同DNA链（同源染色体），在细胞内酶作用下，能够将其切开，发生交叉，然后重新连接，从而发生DNA链交换并引发重组。动物基因工程第21页（1）基因敲除敲除型载体由两段与基因组内靶基因座序列同源DNA片段（又称同源臂）组成，中间为正向选择标识，同缘臂外侧为真核细胞中负选择标识及在原核细胞中进行复制与筛选载体DNA序列。动物基因工程第22页（2）基因敲入基因敲入是利用同源重组原理将外源基因插入到染色体特定位点上。基因敲入转基因结构设计上相同于基因敲除结构，但区分在于：

或用外源基因替换并失活靶基因或在不影响拔基因功效前提下插入新基因或在染色体上特定位点插入新外源基因，从而实现基因转移，并使得外源基因高效表示动物基因工程第23页（3）基因下调（knock-down）

RNA干扰（RNAinterference，RNAi）又被称为基因下调，经过干扰RNA（smallinterferencesiRNA）分子作用到达转录后基因缄默效应。

siRNA制备方法主要包含体外合成siRNA和siRNA表示载体两种。体外合成siRNA易转染细胞，进入细胞后，可直接发挥作用，普通不存在siRNA表示载体转录效率低及细胞毒性等问题。不过体外合成siRNA只能瞬间干扰，不能到达长久抑制病毒效果。

动物基因工程第24页二、基因转移技术

物理转染法

化学转染法

生物法动物基因工程第25页1.物理转染法（1）电击法（electroporation）其基础原理是在外加电场作用下，细胞膜电位发生改变，细胞质膜瞬间出现可逆性电穿孔，从而使一定数量外源DNA从细胞外扩散到细胞质和细胞核内，并深入整合到宿主DNA上，到达转基因目标。动物基因工程第26页图1.利用点穿孔法进行基因转移动物基因工程第27页（2）显微注射法

是将外源DNA在显微镜操作系统辅助下，经过玻璃微管直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵原核内，使外源基因整合到基因组上，制备转基因动物。动物基因工程第28页（3）基因枪法

基础原理是将要转染DNA吸附到高黏度金属（钙或金等）颗粒上，在一个加速装置作用下，将这些粒子高速打入细胞或组织内，到达转基因目标动物基因工程第29页（4）超声波法（sonoporation）

超声波增强基因转染法主要机制是声波空化效应造成细胞通透性增高，而经过添加超生造影剂能降低空化域值，增强空化效应，促进外源基因进入细胞，提升基因转染效果动物基因工程第30页2.化学转染法（1）磷酸钙法

将待转染DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2后，DNA片段与磷酸钙共沉淀并形成大颗粒；将此颗粒悬浮液加入贴壁培养细胞中，外源DNA就被靶细胞所吸收，进而实现转基因。 动物基因工程第31页图2.利用磷酸钙共沉淀法进行DNA转染动物基因工程第32页图3.质脂体介导基因转移（2）脂质体法（lipofection）将待转染DNA溶液与磷脂混合，后者在表面活性剂存在下形成包埋水相DNA脂质体结构。当这种脂质体悬液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜发生融合，DNA片段随即进入细胞质或细胞核内。动物基因工程第33页（3）原生质体融正当

含有目标基因质粒转化细菌或酵母细胞。大量扩增，利用溶菌酶或蜗牛酶去除胞壁个别，在高盐条件下制成原生质体，然后散铺在单层培养哺乳动物细胞上，在融和剂（如聚乙二醇）作用下，使染色体或质粒转如细胞内，实现转基因动物基因工程第34页

构建含有选择性标识反转录病毒基因组个别DNA与质粒杂合型载体分子，在多克隆位点插入外源基因形成重组DNA分子，克隆到大肠杆菌中扩增判定；重组DBA分子经过物理或化学方法转入一个特制病毒包装细胞系。转染入包装细胞系重组DNA转录出对应重组RNA分子，包装细胞系分泌出来重组反转录病毒，便可感染其它类型动物受体细胞，重组RNA分子以DNA形式整合到染色体上，并表示外源基因。3.病毒感染法

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图4逆转录病毒载体稳定、长久表示外源基因

原病毒DNA转染进包装细胞中，包装原病毒产生将病毒RNA包装成感染性病毒粒子全部蛋白质，但却不能包装本身RNA动物基因工程第36页第三节转基因动物制备转基因动物制备程序转基因判定表示水平检测转基因动物传代与检测动物基因工程第37页一转基因动物制备程序DNA显微注射法制备转基因小鼠胚胎干细胞法制备转基因小鼠转基因体细胞核移植法生产转基因牛动物基因工程第38页1、DNA显微注射法制备转基因小鼠超数排卵

基因制备

胚胎移植显微注射

转基因个体判定

动物基因工程第39页动物基因工程第40页显微注射技术动物基因工程第41页2、胚胎干细胞法制备转基因小鼠

胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团中分离出未分化、含有正常二倍体染色体和发育全能性细胞。优点：

能够在体外进行人工培养、长久扩增、冷冻保留动物基因工程第42页胚胎干细胞制备转基因动物过程（1）转基因胚胎干细胞取得（2）囊胚注射（3）嵌合体检测和育种

转基因嵌合个体制备目标是为了取得转基因后代动物基因工程第43页胚胎干细胞基因转化法(引自G1ick&Pasternak，1998)动物基因工程第44页判断是否是种系嵌合

首先用转基因嵌合体小鼠与正常小鼠交配，对其后代进行检测，假如后代中有转基因个体出现，证实为种系嵌合，然后将转基因杂合子个体进行横交就会取得转基因纯合子和杂合子个体。假如在后代中没能发觉转基因纯合子，应注意是否因为转基因纯合造成了胚胎早期死亡，无法得到成活个体所致。动物基因工程第45页基因准备供体细胞获取传代培养、扩增供体细胞转基因

转基因供体细胞筛选与扩增卵母细胞取得体外成熟培养卵母细胞去核核移植重构胚体外培养胚胎移植取得转基因个体3、转基因体细胞核移植法生产转基因牛动物基因工程第46页二转基因判定标识筛选法（1）正负选择标识筛选法（2）无开启子筛选法利用靶基因上开启子来转录标识基因mRNA并翻译出特定蛋白质，而到达筛选目标。分子判定法（1）PCR扩增（2）斑点杂交（3）Southern杂交（4）荧光原位杂交动物基因工程第47页三表示水平检测取得高效表示、含有较强生物学活性目标是蛋白是转基因主要目标之一。得到目标蛋白形式：

表示于细胞内，可经过对组织或细胞裂解获取；分泌到细胞外，可经过酶学或免疫学方法进行测定。动物基因工程第48页1、汇报基因

汇报基因是编码轻易检测蛋白质核苷酸序列，普通用以替换难于测定蛋白质基因，或制备融合蛋白，或利用IRES与目标蛋白形成一条mRNA序列，分别翻译出两种蛋白，来研究目标蛋白功效及其表示特征。动物基因工程第49页2、Northern杂交能够检测转基因动物或转染细胞是否转录出目标基因所对应mRNA3、反转录PCR（RT-PCR）是将由mRNA反转录产生cDNA第一链为模板进行目标基因或片断扩增PCR反应。利用RT-PCR方法扩增出目标基因电泳条带，以检测目标基因是否表示。动物基因工程第50页4、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析靶组织或转基因细胞总蛋白，依据相对分子质量标准判定是否有目标蛋白条带出现，进而判定外源基因表示情况，同时能够初步判定目标蛋白表示水平。5、Western杂交

可用来检测混合蛋白质样品中是否存在目标蛋白，最小检出量为1ng。6、目标蛋白生物活性

应选择对应生物学测定方法进行测定。当产品生物学活性较天然蛋白活性低时，应该对蛋白质结合功效分子集团进行研究。动物基因工程第51页四转基因动物传代与检测判断是否生产出转基因动物主要标准是检验外源基因是否整合到动物生殖系统中，即是否能够稳定遗传。转基因动物传代常见常规繁殖方法进行，如有必要，也可采取特殊方法。普通用转基因检测阳性动物与已知非转基因动物交配，这么做能够很好度量被整合外源基因传递规律。

动物基因工程第52页第四节转基因动物应用与未来一、转基因动物应用二、转基因动物生物安全性三.动物转基因未来动物基因工程第53页一、转基因动物应用

提升动物生产性能（1）改良畜禽生产性状

在转基因“硕鼠”启发下，大家试图经过外源基因导入提升畜禽产品产量，加紧生长速度，降低饲料消耗和改良产品品质。（2）提升畜禽抗病力

传染病流行以及动物源性人畜共患病暴发，已对畜牧生产和人类生活产生了巨大影响。动物基因工程第54页转基因“硕鼠”（右）动物基因工程第55页转基因鱼转基因牛转基因猪动物基因工程第56页2.动物生物反应器

转基因动物出现引导大家试