高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用

高通量测序技术及其在肿瘤研究中应用汇报人：高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用第1页目录

背景介绍1

测序流程2对肿瘤研究方法3

总结4高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用第2页一、背景介绍高通量测序技术（High-throughputsequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation”sequencingtechnology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和普通读长较短等为标志。高通量测序技术是对传统测序一次革命性改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，所以在有些文件中称其为下一代测序技术(nextgenerationsequencing)足见其划时代改变，同时高通量测序使得对一个物种转录组和基因组进行细致全貌分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。

什么是高通量测序?高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用第3页第二代测序第三代测序第一代测序

传统化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们基础上发展来测序技术统称为第一代测序。它在分子生物学研究中发挥过主要作用，如人类基因组计划

主要包含罗氏454企业454测序技术、Illumina企业Solexa测序技术和ABI企业SOLiD测序技术。第二代测序技术最显著特征是高通量，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序

第三代DNA测序技术是以单分子测序为特点，如生物科学企业单分子测序仪，以及正在研制太平洋生物科学企业单分子实时DNA测序技术和牛津纳米孔技术企业纳米孔单分子测序技术等开始20世纪80年代中期正在研发测序发展历程高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用第4页

当前常说高通量测序是指用第二代测序技术来进行测序，第三代测序技术还不是很成熟，有刚才出现，有则正在研制企业平台名称

测序方法

检测方法大约读长优点相对不足Roche/454基因组测序仪FLX系统焦磷酸测序法光学230-400在第二代中最高读长；比第一代测序通量大样品制备较难；难于处理重复和同种碱基多聚区域；试剂冲洗带来错误累积；仪器昂贵IlluminaHiSeq,HiSeq2500/MiSeq可逆链终止物和合成测序法荧光/光学2x150很高测序通量仪器昂贵；用于数据删节和分析费用较高ABI/Solid5500xlSolid系统连接测序法荧光/光学25-35很高测序通量；在广为接收几个第二代平台中，试剂成本最低测序运行时间长；读长短，造成成本高，数据分析困难和基因组拼接困难；仪器昂贵第二代主要测序平台主要测序平台高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用第5页数据分析

样品制备

文库构建二、测序流程

测序流程上机测序Descriptionofthecompany’sproductsDescriptionofthecompany’sbusinessDescriptionofthecompany’stechnologyDescriptionofthecompany’scontents1.对测序后生成数据进行分析2.普通分析：去除低质量数据，进行序列组装，评定测序质量等3.高级分析：对基因进行注释，分析表示情况、构建互做网络等1.在第二代测序仪上进行测序，设定程序1.DNA序列打断、RNA序列要反转录为DNA序列再打断（超声破碎）200-300bp2.加接头，电泳选择片段大小3.PCR扩增，转到Flowcell上4.文库质检（QPCR)1.组织样品培养或病理样品搜集2.样品总DAN、RNA提取3.质检（总量、纯度、完整性、有没有降解等）高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用第6页三、对肿瘤研究方法DNA

1.实体肿瘤基因组学研究2.血液肿瘤基因组学研究3.表观遗传学研究4.免疫组学研究高通量测序在肿瘤研究应用RNA1.实体肿瘤转录组学研究2.血液肿瘤转录组学研究3.Exosome研究肿瘤细胞通讯、扩散机制高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用第7页DNA方向1.实体肿瘤基因组学研究一.研究目标和意义寻找适合用于肿瘤早期诊疗、肿瘤分型、病程发展（恶化和转移）和预后基因组分子标识，筛选药品靶标。二.研究对象实体肿瘤判别，按照临床病理分类，比如：肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、膀胱癌、食道癌、肾癌等。三.测序方案Exomecaptureseq（外显组捕捉测序）描绘基因组外显子区域SNV（单核苷酸变异），Indel（插入缺失）、CNV（拷贝数变异），分析基因变异和癌症相关性。Targetcaptureseq（目标捕捉测序）对一些功效富集基因或研究人员感兴趣基因组部分区域进行捕捉，分析基因变异对癌症影响。比如：癌症相关基因（508个）、免疫（883个）、凋亡（1536个）、细胞周期（1005个）、p53通路（162个）等。Wholegenomeseq（全基因组测序）对基因组上全部基因进行测序分析，找到大量SNV、CNV、Indel、SV（结构变异）等基因变异信息，更为全方面解析癌症发生发展分子机制。四.案例解析1.外显组测序判定体细胞突变2.外显组测序分析拷贝数和基因融合3.全基因组重测序展示人类首个癌基因组图谱4.全基因组测序解析基因组拷贝数变异高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用第8页DNA方向2.血液肿瘤基因组学研究一.研究目标和意义寻找适合用于白血病早期诊疗、疾病分期或分级、预后分子标识，药品筛选靶标，指导个体化用药分子依据。二.研究对象血液病类型：骨髓增生异常综合症（MDS），多发性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病（急性粒细胞白血病）。三.测序方案Exomecaptureseq（外显组捕捉测序）描绘基因组外显子区域SNV（单核苷酸变异），Indel（插入缺失）、CNV（拷贝数变异），分析基因变异和癌症相关性。Targetcaptureseq（目标捕捉测序）对一些功效富集基因或研究人员感兴趣基因组部分区域进行捕捉，分析基因变异对癌症影响。比如：癌症相关基因（508个）、免疫（883个）、凋亡（1536个）、细胞周期（1005个）、p53通路（162个）等。Wholegenomeseq（全基因组测序）对基因组上全部基因进行测序分析，找到大量SNV、CNV、Indel、SV（结构变异）等基因变异信息，更为全方面解析癌症发生发展分子机制。四.案例解析1.对4个慢性淋巴细胞性白血病（CLL）进行全基因组测序分析，在染色体13q14上有3位患者出现了基因组大片段缺失。2.研究者选取22个FLT3-ITD突变阳性患者及29个FLT3-ITD阴性患者进行目标区域捕捉测序研究，能够检测到FLT3不一样位置ITD，并在FLT3-ITD阴性患者基因组上发觉了比较低频ITD，为白血病分子诊疗提供了更为准确信息。高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用第9页DNA方向3.表观遗传学研究一.研究目标和意义DNA甲基化是表观遗传学研究重点，是基因调控伎俩之一，在维持细胞正常功效、传递基因组印记、胚胎发育和肿瘤发生等方面起着至关主要作用。检测表观遗传学变异尤其是基因组甲基化，探讨甲基化对于生物学功效影响，并筛选可应用作为疾病早期诊疗、分级和分型分子标识。二.研究对象研究对象：各类肿瘤、发育、干细胞分化不一样阶段。三.测序方案RRBS（ReducedRepresentationBisulfiteSequencing）基于Msp|酶切消化和bisulfite处理高性价比喻法，可对基因组promoter区及CpG岛区域DNA甲基化状态进行样品之间比较分析。

MBD-Seq（MethylatedDNABindingDomainSequencing）因为在哺乳动物中甲基化普通发生在CpG胞嘧啶5位碳原子上，所以可经过特异性结合甲基化DNA蛋白MBD2b富集高甲基化DNA片段，并结合第二代高通量测序，对富集到DNA片段进行测序，从而检测全基因组范围内甲基化位点。

MeDIP-Seq（MethylatedDNAImmunoprecipitationSequencing）经过使用5'-甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化DNA片段，然后将富集后DNA进行高通量测序。

BS（BisulfiteSequsencing）Bisulfite处理能够将基因组中未甲基化C碱基与甲基化C碱基区分开来，所以成为表观遗传学研究经典试验方法。将Bisulfite处理与高通量测序技术结合BisulfiteSequencing能够绘制单碱基分辨率DNA甲基化图谱，可用于研究特定DNA区域甲基化与特定表型之间关联。高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用第10页DNA方向4.免疫组学研究一.研究背景T细胞受体（Tcellreceptor，TCR）是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答分子，是人类基因组中多态性最高区域之一，决定着人免疫系统怎样适应环境改变。T细胞受体库多样性（包含基因重组以及选择性表示）直接反应了机体免疫应答状态。二.适用范围肿瘤免疫、本身免疫性疾病、器官移植免疫监测、疫苗注射免监测三.案例解析目标：

目标：干细胞移植（HSCT）后，经过对TCR（T细胞受体）CDR3（VDJ基因重组区域）区域进行重组分析取得移植后病人CD4+和CD8+T细胞多样性，从而检测移植受体免疫重建结果。经过比较不一样起源干细胞（造血干细胞、去除T细胞造血干细胞、脐血干细胞）移植后TCR多样性进行移植效果判断，并阐述TCR多样性与细菌感染关系。

方法：选取干细胞移植病人作为研究对象，时间点为移植后6个月和12个月，以健康人作为对照。从8ml外周血中分理CD4+和CD8+T细胞处利用高通量测序技术结合生物信息学分析检测TCRCDR3区域重组多样性。结果：1.对去除T细胞（TCD）干细胞移植病人测序结果分析发觉移植病人TCR多样性比健康人要低。

2.对不一样起源干细胞进行TCR多样性分析，发觉脐血干细胞移植后，TCR多样性最高，且CD4+起源TCR比CD8+起源TCR多样性高。3.年纪和供体对干细胞移植后TCR多样性影响不大，不过出现急性移植物抗宿主病及全身类固醇治疗病人有着较高TCR多样性，相反，出现巨细胞病毒（CMV）疱疹病毒（EBV）感染病人TCR多样性比较低。高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用第11页RNA方向1.实体肿瘤转录组学研究一.研究目标和意义寻找适合用于肿瘤早期诊疗、肿瘤分型（在分子水平对疾病能够准确分型）、病程发展（恶化和转移）和预后转录组分子标识，筛选药品靶标，用药分子依据。二.研究对象实体肿瘤判别，按照临床病理分类，比如：肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、膀胱癌、食管癌、鼻咽癌、肾癌、淋巴瘤等。三.测序方案RNA-seq（PolyA法mRNA测序）发觉癌症发生或转移相关mRNA变异（几乎全部基因表达量差异、基因融合和选择性剪切等事件）。

SmallRNA-seq（小RNA测序）分析miRNA表示量差异，预测miRNA作用靶基因，筛选可用于疾病诊疗和预后分子标识。

lncRNA-seq（长链非编码RNA测序）经过PolyA尾抓取或核糖体RNA去除方法，富集mRNA和lncRNA，能够发觉样品中新lncRNA，并同时检测样本中mRNA和lncRNA，进行共表示分析，以mRNA功效富集分析挖掘lncRNA功效和潜在作用机制，探讨lncRNA和疾病关系。四.案例解析高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用第12页RNA方向2.血液肿瘤转录组学研究一.研究目标和意义寻找适合用于白血病早期诊疗、疾病分期或分级、预后分子标识，药品筛选靶标，指导个体化用药分子依据。二.研究对象

血液病类型：骨髓增生异常综合症（MDS），多发性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病（急性粒细胞白血病）。三.测序方案RNA-seq（PolyA法mRNA测序）发觉癌症发生或转移相关mRNA变异（几乎全部基因表达量差异、基因融合和选择性剪切等事件）。SmallRNA-seq（小RNA测序）分析miRNA表示量差异，预测miRNA作用靶基因，筛选可用于疾病诊疗和预后分子标识。lncRNA-seq（长链非编码RNA测序）经过PolyA尾抓取或核糖体RNA去除方法，富集mRNA和lncRNA，能够发觉样品中新lncRNA，并同时检测样本中mRNA和lncRNA，进行共表示分析，以mRNA功效富集分析挖掘lncRNA功效和潜在作用机制，探讨lncRNA和疾病关系。四.案例解析高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用第13页RNA方向3.Exosome研究肿瘤细胞通讯、扩散机制一.研究背景Exosome起源于晚期核内体(也称为多囊泡体)囊泡，是由活细胞