氨基酸发酵机制

氨基酸发酵机制氨基酸发酵机制第1页新型甜味剂-蛋白糖/zz3-12.htm

新型甜味剂阿斯巴甜又名蛋白糖，是天门冬氨酸和苯丙氨酸合成二肽甜味剂，是一个相当蔗糖甜度200倍低热值高甜度新型甜味剂。它含有安全、易吸收、不致龋齿等优点，可供糖尿病患者及忌糖者婴幼儿食用，是老年营养食品和保健食品优良甜味剂；能够制成新型糖替换品直接加入饮料或食品中；大量用于饮料，果酱、口香糖、乳制品、罐头、蜜饯婴幼儿食品等各种食品中，至今已经有3000各种食品使用阿斯巴甜。该产品在法国首次同意使用，当前世界已经有80余个国家和地域同意使用，仅欧美国家年需求量约6000-7000吨，据预测近期世界市场每年将以20％速度增加。我国80年代开始了该项目研究工作，亚运会期间在我国首次将国产阿斯巴甜用于“真珠陈皮”唯一甜味剂，取得成功。氨基酸发酵机制第2页在医药工业上应用：氨基酸在医药上应用很广。比如，氨基酸混合液可供病人注射用，氨基酸混合粉剂可作宇航员、飞行员补品。在化装品生产中应用：氨基酸及其衍生物与皮肤成份相同，含有调整皮肤pH和保护皮肤功效，现已广泛用于配制各种化装品。比如，胱氨酸用于护发素中，丝氨酸用于面霜中。在农业上应用：赖氨酸、蛋氨酸添加在饲料中，能加速家畜、家禽生长，改进肉质量。氨基酸也用于其它方面：比如，聚谷氨酸用于合成人造皮革和涂料。氨基酸发酵机制第3页第一节氨基酸发酵代谢调控

正常情况下微生物本身不能累积氨基酸，所以要打破微生物正常代谢调整路径。经常采取几个方法：1、控制旁路代谢：以D-苏氨酸为底物发酵

D-苏氨酸L-苏氨酸脱氢酶脱氢酶

a-酮基丁酸反馈抑制

L-异亮氨酸氨基酸发酵机制第4页2、降低反馈作用物浓度：谷氨酸

N-乙酰谷氨酸

N-乙酰-Y-谷氨酰磷酸鸟氨酸反馈抑制瓜氨酸精氨酸谷氨酸棒杆菌缺乏将鸟氨酸转化为瓜氨酸酶，消除反馈抑制，可用于生产鸟氨酸。氨基酸发酵机制第5页3、控制细胞渗透性：谷氨酸发酵：当细胞内生物素水平高时，谷氨酸不能透过细胞膜，需加入表面活性剂或青霉素，提升细胞膜通透性。4、控制发酵环境：氨基酸发酵是人为控制环境结果，见表5-15、促进ATP积累以利氨基酸生物合成：氨基酸合成需要能量，ATP积累有利于氨基酸生物合成。氨基酸发酵机制第6页第二节谷氨酸发酵机制

谷氨酸，学名：α-氨基戊二酸；其单钠盐：谷氨酸钠，商品名称味精，是主要调味品。当前我国味精年产量已达100万吨，产销量占世界第一位。早期生产谷氨酸方法有两种，一是提取法：甜菜厂付产物糖蜜中含有焦谷氨酸，用强碱处理可得到谷氨酸；二是蛋白质水解法：将面筋加酸水解，再分离提纯。1957年发酵法生产谷氨酸在日本协和发酵企业投产。氨基酸发酵机制第7页

谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量300多倍谷氨酸，研究发觉：大量积累并非是当初构想因为特异代谢路径造成，而是：

①代谢调整控制；

②细胞膜通透性特异调整；

③发酵条件适合；综合调控结果。氨基酸发酵机制第8页一、谷氨酸生物合成路径及调整机制谷氨酸生物合成路径大致是：葡萄糖经糖酵解（EMP路径）和己糖磷酸支路（HMP路径）生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A（乙酰COA），然后进入三羧酸循环，生成α－酮戊二酸。α－酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶催化及有NH4+存在条件下，生成谷氨酸。即，谷氨酸生物合成路径包含EMP、HMP、TCA循环、DCA循环和CO2固定作用等。氨基酸发酵机制第9页氨基酸发酵机制第10页氨基酸发酵机制第11页一）EMP路径、HMP路径

谷氨酸生产菌存在着两种代谢路径：EMP、HMP；EMP/HMP=90/10，生物素量增加，HMP路径增加（26%，38%）。二）TCA、DCA和CO2固定作用

1.TCA环（三羧酸循环）

α—KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失这是菌体生成并积累α—KGA关键，从上图能够看出，α—KGA是菌体进行TCA循环中间性产物，在α—KGA脱氢酶作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，只有当体内α—KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停顿，α—KGA才得以积累。在有NH4＋存在下，由谷氨酸脱氢酶催化还原氨基化生成谷氨酸。氨基酸发酵机制第12页

2.DCA环（乙醛酸循环）菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）关键酶——异柠檬酸裂解酶。该酶是一个调整酶，或称为别构酶，其活性能够经过某种方式进行调整，经过该酶酶活性调整来实现DCA循环封闭，DCA循环封闭是实现GA发酵首要条件。

3.CO2固定体系中假如不存在CO2固定反应，则有：

氨基酸发酵机制第13页则3/2C6H12O6+NH4+==C5H9O4N+4CO2产率：147/（180*3/2）==54.4%氨基酸发酵机制第14页体系中存在CO2固定反应，则有：

氨基酸发酵机制第15页则有：

C6H12O6+NH4+==C5H9O4N+CO2产率：147/180==81.7%

可见，在GA生物合成过程中，CO2固定反应对于产率提升有着多么主要作用。在许多微生物发酵过程中，通常需要检测反应器尾气组成，尤其是尾气中CO2含量，其主要目标就在于分析产物合成期间菌体代谢路径，有利于指导生产。氨基酸发酵机制第16页三）氨导入

有三种方式：①α－酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸。GA产生菌有强烈L—谷氨酸脱氢酶活性

α—KGA+NH4++NADPH==GA+NADP②由天冬氨酸或丙氨酸经过氨基转移作用将氨基转给α－酮戊二酸而生成GA。不过谷氨酸产生菌中天冬氨酸转氨酶(GOT)和丙氨酸转氨酶(GPT)活力很低，转氨路径并不主要。③谷氨酸合成酶路径。谷氨酸合成酶对NH4＋亲和力比谷氨酸脱氢酶强得多，当环境中NH4＋浓度很低时，可由谷氨酸合成酶路径合成谷氨酸。细胞内谷氨酸浓度很高时，反馈抑制谷氨酸脱氢酶活性，但不抑制谷氨酸合成酶。

氨基酸发酵机制第17页二细胞膜通透性控制细胞膜通透性调整对于GA发酵时非常主要，当菌体进入产物合成期时，开始有GA产生，这是假如能够大量把产物及时排泄到细胞膜外，能够解除GA对L—谷氨酸脱氢酶活性抑制作用，从而实现由Glucose到GA高效率转化。可见，改进细胞膜通透性主要性，怎样进行呢？

氨基酸发酵机制第18页

通常谷氨酸发酵采取菌种都是生物素缺点型，而生物素又是菌体细胞膜合成必须物质，生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需乙酰CoA辅酶。生物素缺点型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸合成。所以，能够经过控制生物素浓度，来实现对菌体细胞膜通透性调整。生物素对细胞膜合成影响主要是经过对细胞膜主要成份——磷脂(结构见图5-8)中脂肪酸生物合成来实现，当限制了菌体脂肪酸合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整菌体。生物体内脂肪酸合成路径以下：氨基酸发酵机制第19页氨基酸发酵机制第20页三、菌种选育模型与控制方法

控制磷脂合成使细胞膜受损（如表面活性剂）青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜

经过油酸合成

控制磷脂含量

经过甘油合成

直接控制磷脂合成提升细胞膜谷氨酸通透性氨基酸发酵机制第21页

谷氨酸产生菌选育：

1.选育生物素缺点型

生物素是脂肪酸生物合成中乙酰－CoA羧化酶辅酶，生物素促进脂肪酸合成，再由脂肪酸合成磷脂。选育生物素缺点型菌株，阻断生物素合成，最终造成磷脂合成不足，细胞膜结构不完整，提升细胞膜谷氨酸通透性。所以，控制生物素含量能够改变细胞膜成份，进而改变膜透性、谷氨酸分泌和反馈调整。表面活性剂对生物素有拮抗作用，阻断不饱和脂肪酸合成，使磷脂合成受阻。青霉素直接作用在于抑制细胞壁合成。细胞膜失去细胞壁保护而发生继发性改变。氨基酸发酵机制第22页2.选育油酸缺点型：不饱和脂肪酸是磷脂组成个别。选育油酸缺点型，阻断不饱和脂肪酸合成，并限制外源供给量，就可限制磷脂合成。3.选育甘油缺点型：该菌株缺失α－磷酸甘油脱氢酶，由磷酸二羟丙酮合成α－磷酸甘油路径被阻断。

4.选育温度敏感型突变株：找到高温下细胞膜合成有缺损突变株。5.其它，如营养缺点型；药品抗性突变株；敏感型突变株等。表5-5，表5-6氨基酸发酵机制第23页第三节赖氨酸发酵机制一、行业介绍：

Lys是人体所必需8种氨基酸之一，（ThrValLeuILePheMetLystry，苏、颉、亮、异亮、苯丙、蛋、赖、色），Lys主要来自于动物蛋白质。发酵法赖氨酸生产最早起源于日本，我国80年代中期相继有赖氨酸发酵生产厂家。80年代赖氨酸食品曾经非常盛行。

/chi/lysine.html氨基酸发酵机制第24页我国Lys生产与国外差距主要表现在：（1）菌种性能差异，Lys是菌体代谢过程中中间性产物，但不是主链上产物，其生成机制很复杂，对菌种要求很高，我国菌种产酸水平为：35—55g/L，转化率为：20—25%，远低于国外生产水平；（2）提取率较低；（3）生产规模较小。氨基酸发酵机制第25页二、赖氨酸生物合成路径

当前已知赖氨酸生物合成路径有两条，一条以细菌类为主、另一条以酵母菌为主。因为酵母菌体内赖氨酸生物合成产率要低于细菌类，所以，当前赖氨酸发酵生产都是采取细菌为生产菌种。

氨基酸发酵机制第26页细菌类发酵与酵母菌发酵比较：优点：（1）菌体体积较小，相对增殖所用底物较少，产率高。（2）细菌繁殖速度快，在适当生长条件下，其繁殖速度只有十几分钟，而酵母增殖速度最少在一个小时以上，这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件。（3）细菌细胞膜通透性易于调整，对于胞外产品，能够经过其细胞膜通透性控制来促进产物分泌，比如，GA发酵；对于胞内产物，其细胞壁比酵母细胞壁易于破碎。

氨基酸发酵机制第27页缺点：1）细菌菌体较小，当需要从发酵液中把菌体分离出来（有利于产物结晶提出，或产物就是菌体或菌体内胞内物），细菌比酵母菌难以分离。2）细菌发酵过程中无菌程度要求非常严格，发酵过程中大个别细菌对于溶氧要求也很高，这就增加了细菌发酵生产成本。3）细菌发酵易感染噬菌体。氨基酸发酵机制第28页大肠杆菌中Lys生物合成与代谢调控

氨基酸发酵机制第29页氨基酸发酵机制第30页氨基酸发酵机制第31页氨基酸发酵机制第32页大肠杆菌赖氨酸代谢特点：关键酶：天冬氨酸激酶是一个同功酶，分别受三个代谢产物抑制，这三个终产物分别是：Lys、Met和Thr，只有当这三个代谢产物同时过量时，Asp激酶活性才能完全被抑制。同功酶：天冬氨酸激酶1，天冬氨酸激酶2，天冬氨酸激酶3，三个酶催化同一反应，但其活性受不一样代谢产物体调整酶。

氨基酸发酵机制第33页依据上述代谢特点，要使菌体合成并积累Lys，能够选育高丝氨酸脱氢酶缺点型Hos-，这么话，既能够解除β—天冬氨酸代谢支路，使代谢流向Lys方向进行，提升了从底物葡萄糖到产物转化率；更主要是因为Hos-，使得代谢过程中不可能产生过量Met、Thr，尽管产生了大量Lys，Lys能够抑制关键酶——天冬氨酸激酶3，不过天冬氨酸激酶1、2活性因为Met、Thr限量，并没有受到抑制，也就是说，天冬氨酸β—半醛，仍能够大量生成，这就确保了Lys生物合成路径通畅无阻。氨基酸发酵机制第34页三、赖氨酸生产菌育种路径首先，选择出发菌株。不一样微生物赖氨酸生物合成调整机制不一样，应该选择代谢调整机制比较简单细菌作为出发菌株，如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌和乳糖发酵短杆菌等。其次，依据菌株特征选育赖氨酸产生菌。方法有：①优先合成转换－选育渗漏缺点型选育高丝氨酸脱氢酶渗漏缺点型，此突变株高丝氨酸脱氢酶活性仅为野生株1/30，于是合成苏氨酸少，不足以与赖氨酸共同对天冬氨酸激酶活性产生协同反馈抑制作用，就能够过量积累赖氨酸。需要注意，活性很低高丝氨酸脱氢酶轻易受苏氨酸抑制和蛋氨酸阻遏，对应地造成苏氨酸或蛋氨酸缺乏，而抑制生长。氨基酸发酵机制第35页②切断支路代谢－选育营养缺点型诱变选育高丝氨酸缺点型（高丝氨酸脱氢酶缺失），切断通向苏氨酸、蛋氨酸代谢流，同时控制培养液中高丝氨酸（或苏氨酸＋蛋氨酸）量，降低苏氨酸浓度，解除赖氨酸＋苏氨酸对天冬氨酸激酶协同反馈抑制作用，从而过量积累赖氨酸。氨基酸发酵机制第36页③选育抗结构类似物突变株经过诱变使编码天冬氨酸激酶结构基因发生突变，使天冬氨酸激酶对赖氨酸及其结构类似物（S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸，AEC）不敏感，即使在过量苏氨酸存在时，该酶也不与赖氨酸或其结构类似物结合，但酶活性中心不变。这种突变株遗传性地解除了终产物对本身合成路径酶调整控制，不受培养基中所要求物质浓度影响。只有抗性菌株其赖氨酸产量不高，而含有抗性兼有营养缺点型菌株，赖氨酸产量大为提升。氨基酸发酵机制第37页④解除代谢互锁在乳糖发酵短杆菌中，赖氨酸生物合成与亮氨酸生物合成之间存在代谢互锁。赖氨酸生物合成份支路径第一个酶—二氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶合成受亮氨酸阻遏，使丙酮酸通向赖氨酸代谢受阻，而流向丙氨酸、缬氨酸。解除这种代谢互锁方法有：选育亮氨酸缺点型菌株；选育抗亮氨酸结构类似物（2－噻唑丙氨酸）突变株；选育对苯醌或喹啉衍生物敏感株（即亮氨酸渗漏缺点型菌株）。氨基酸发酵机制第38页⑤增加前体物合成和截断副产物生成：增加天冬氨酸浓度，天冬氨酸激酶与底物亲和力协同性增大，能够抵消变构抑制剂影响，使前体物（丙酮酸、草酰乙酸、天冬氨酸等）充分地用于合成赖氨酸。增加前体物合成可采取方法有：A.选育丙氨酸缺点型；B.选育抗天冬氨酸结构类似物（天冬氨酸氧亏酸，ASPHX）突变株；C.选育适宜CO2固定酶／TCA循环酶活性比突变株。⑥改进细胞膜透过机理氨基酸发酵机制第39页⑦选育温度敏感突变株：假如突变位置发生在为亮氨酸合成酶系编码基因中，使翻译出来酶对温度敏感，则高温时就不能合成亮氨酸，即成为亮氨酸缺点型，可解除代谢互锁。有实用价值赖氨酸高产菌株多为营养缺点、敏感性、结构类似物抗性等性状双重、三重或多重标识突变株。⑧应用细胞工程和遗传工程育种把依靠诱变技术取得优良特征经过重组DNA技术加以组合和应用。氨基酸发酵机制第40页⑨预防高产菌株回复突变预防菌株回复突变至关主要。其方法除了经常进行菌种纯化、检验遗传标识、降低传代次数、不用发酵液作为种子外，还可采取以下方法：A.选育遗传性稳定菌株；B.定向赋加生产菌多个遗传标识。反抗性菌株，尽可能育成多重抗性，增加抗回复突变，使生产性能稳定；C.菌种培养和保藏时，培养基要丰富，尤其有足够要求营养物。反抗性菌株，应添加所耐类似物；D.在培养突变株时添加抗生素（如红霉素、氯霉素），抑制恢复突变株生长，使其到达分离纯化目标。氨基酸发酵机制第41页第四节芳香族氨基酸发酵机制

芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸分子中都含有苯环结构，所以称作芳香族氨基酸。这三种氨基酸在结构上另一个共同点，是其直链都是丙氨酸。氨基酸发酵机制第42页人体酪氨酸是由苯丙氨酸转化而得。苯丙氨酸、色氨酸是必需氨基酸，用作氨基酸输液。因为色氨酸是玉米中所缺乏氨基酸，故又用于饲料添加剂，另外，苯丙氨酸是二肽甜味剂原料。氨基酸发酵机制第43页DAHP合成酶（DS）氨基酸发酵机制第44页分支酸变位酶（CM）氨基酸发酵机制第45页芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成调整机制：1、DAH