生殖器官培养专家讲座

培养对象花药培养、花粉培养子房培养、胚珠培养、胚培养、胚乳培养离体受精生殖器官培养专家讲座第1页第一节花药和花粉培养生殖器官培养专家讲座第2页一、概述概念花药培养:把发育到一定阶段花药接种在人工培养基上,使其发育和分化成为植株过程.花粉培养(小孢子培养):从花药中分离出花粉粒,使之成为分散或游离状态,经过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株过程.花药培养和花粉培养是获是植物单倍体有效方法之一生殖器官培养专家讲座第3页二倍体(diploid)植物其单倍体（haploid）即一倍体（monoploid）如，玉米2n=2x=20n=x=10；水稻2n=2x=24n=x=12四倍体(tetraploid)植物其haploid为dihaploid如，马铃薯2n=4x=48，n=2x=24六倍体(hexaploid)植物其haploid为triploid如，普通小麦2n=6x=42，n=3x=21八倍体(octoploid)植物其haploid为tetraploid如，草莓2n=8x=56，n=4x=28单倍体(haploid)是不是就是一倍体呢？单倍体(haploid)——指含有配子体（gametophyte）染色体数孢子体(植物个体)(sporophyte)。

生殖器官培养专家讲座第4页体细胞染色体数减半；单倍体植物与二倍体相比较，有三个显著特点：生长发育弱，体形小、各器官显著减小；雌雄配子严重败育，有甚至不能进入有性世代。

生殖器官培养专家讲座第5页（二）花药或花粉培养在作物育种中作用：供体植株小孢子（N）花粉培养花粉植株（N）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株（2N）（1）缩短育种年限：常规育种需4-6年取得纯系，而小孢子培养仅需1-2年。一年内取得纯系生殖器官培养专家讲座第6页例：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb纯合单株常规方法：AAbb出现概率为1/16，而且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。

（2）提升了目标基因型选择效率

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb

Aabbab aAbB aabB aAbb aabb生殖器官培养专家讲座第7页例：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb纯合单株单倍体方法：AAbb出现概率为1/4。

单倍体

二倍体

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供体亲本AaBb花粉培养

（2）提升了目标基因型选择效率生殖器官培养专家讲座第8页植株不受显隐性影响，在诱变育种中能在当代及时取得突变个体，加倍后成为稳定纯系。

（3）诱变育种中作用

（4）利于筛选隐性突变体提升诱变效率

生殖器官培养专家讲座第9页（5）利于取得优良植株

生殖器官培养专家讲座第10页（6）应用于远缘杂交，克服不育性生殖器官培养专家讲座第11页花药结构及花粉管形成花药结构及花粉粒发育2NN减数分裂生殖器官培养专家讲座第12页

四分体4个单核花粉粒（细胞壁薄、细胞质浓、核位于细胞中央）

营养细胞（大）单核花粉粒（单核靠边期）（二者仅以质膜相隔）精细胞生殖细胞（小）有丝分裂

（2-细胞花粉粒）精细胞(3-细胞花粉粒）N双核早期生殖器官培养专家讲座第13页（三）花药和花粉培养中雄核发育路径1、A路径小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞（1）A-V路径由营养细胞重复分裂形成单倍体（2）A-G路径由生殖细胞重复分裂形成单倍体（3）A-VG路径（E路径）由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体（4）C路径营养细胞和生殖细胞经过核融合，形成多倍体植株生殖器官培养专家讲座第14页2、B路径小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近两个细胞。然后由这两细胞连续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株。（三）花药和花粉培养中雄核发育路径生殖器官培养专家讲座第15页生殖器官培养专家讲座第16页（四）花药培养与花粉培养异同点培养目标相同，均取得小孢子植株。花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。花粉培养没有药壁组织干扰，单倍体产量高。生殖器官培养专家讲座第17页（一）研究历史：首先报道经过花药培养取得单倍体植株成功是印度学者Guha和Maheshwari(1964,1966)。1996年统计数据表明,已经有最少250各种植物花药培养成功。花药培养取得单倍体技术路径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物育种中广泛应用。二、花药培养技术生殖器官培养专家讲座第18页（二）花药培养基本程序是：外植体选择－消毒—剥取花药—接种—诱导培养—植株再生外植体选择：供试材料遗传背景，供试材料生理状态，花粉发育时期等。生殖器官培养专家讲座第19页

四分体4个单核花粉粒（细胞壁薄、细胞质浓、核位于细胞中央）

营养细胞（大）单核花粉粒（单核靠边期）（二者仅以质膜相隔）精细胞生殖细胞（小）有丝分裂

（2-细胞花粉粒）精细胞(3-细胞花粉粒）N双核早期生殖器官培养专家讲座第20页选择花药时，普通经过镜检来确定其中花粉是否处于适宜发育期。最惯用方法有醋酸洋红法。不过，一些植物花粉细胞核不易着色，需采取焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。生殖器官培养专家讲座第21页Differentflowerstagesasusedinantherculture.

Stage2istheoptimumstageofdevelopment

foruseintobaccoantherculture生殖器官培养专家讲座第22页（二）花药培养基本程序是：外植体选择－消毒—剥取花药—接种—诱导培养—植株再生花药剥取：防止花药受到损伤，因为损伤常会刺激花药壁组织发育，形成二倍体愈伤组织。生殖器官培养专家讲座第23页（二）花药培养基本程序是：外植体选择－消毒—剥取花药—接种—诱导培养—植株再生生殖器官培养专家讲座第24页花药培养惯用基本培养基：N6：高硝态氮，低铵态氮，广泛用于禾本科植物花药培养B5、MS、White、Nitch等。C17（王培等，1986）：适于小麦花药培养，提升出愈率。激素：相对较低激素水平蔗糖：普通2-3%，高浓度对禾谷类较有利

番茄花药培养对蔗糖浓度诱导反应蔗糖浓度2％3％4％6％10％13％17％

诱导频率5％10％12％18％25％45％8％培养条件－温度和光照：生殖器官培养专家讲座第25页温度柑橘在20°C以下，完全不能形成胚状体，且愈伤组织形成亦极少，当将温度提升到21～25°C时便会有胚状体形成，而当温度提升到26°C以上时又完全不能形成胚状体。油菜若将接种后花药在30°C条件下培养2～3天，可显著提升花粉胚形成率，小麦在33°C条件下培养3～5天，可提升成愈率和绿苗率光照：先弱后强生殖器官培养专家讲座第26页三、花粉培养技术1、取材时期：四分体时期到单核早期。2、花粉分离：3、小孢子纯化：对取得小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子4、花粉培养生殖器官培养专家讲座第27页生殖器官培养专家讲座第28页1）自然散落法(漂浮培养自然释放法)：将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，搜集培养。2）机械游离法a.磁搅拌法：用磁力搅拌器低速搅拌培养液中花药，使花粉游离出来；b.挤压法：在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后搜集培养。生殖器官培养专家讲座第29页花粉培养方法1、平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养：花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养：先铺一层琼脂固体培养基（加入失活花药浸提液），凝固后，在表面加入少许液体培养基培养。4、看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出活性物质促进花粉小孢子发育。5、微室培养：利用小盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。生殖器官培养专家讲座第30页看护培养图解生殖器官培养专家讲座第31页

1、胚状体发育路径：小孢子经历胚发生各个阶段，最终子叶展开，形成花粉植株。四、花粉植株形态发生方式烟草花药培养——经过胚状体路径再生形成小植株生殖器官培养专家讲座第32页

1、胚状体发育路径：小孢子经历胚发生各个阶段，最终子叶展开，形成花粉植株。2、愈伤组织发育路径：小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此路径产生植株会出现变异且倍性复杂。四、花粉植株形态发生方式生殖器官培养专家讲座第33页愈伤组织转接种到