第六节转录后处理转录产物的修饰-真核生物mRNA的帽子和尾巴公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件

第六节转录后处理

转录产物修饰——真核生物mRNA帽子和尾巴第1页第1页在真核生物中，大部分成熟mRNA都含有5’帽子，同时还含有3’多聚A尾巴。这是真核生物mRNA主要特性。第2页第2页一、帽子成熟mRNA分子没有自由5’端。5’端是一个以5’-5’三磷酸二酯键相连二核苷酸，并且在5’一个核苷酸总是N7-甲基鸟氨酸（m7GpppX），不能被RNAase水解。mRNA5’端这种结构就称为帽子。第3页第3页不同真核生物mRNA含有不同帽子,同一个生物也常含有不同帽子。N7-甲基鸟氨酸（m7GpppX）称为帽子0，单细胞真核生物，如酵母，只有帽子0。如在原来转录物第一个核苷酸2’-O位上产生甲基化，则组成帽子1（包含帽子0），其符号为m7GpppXm。这是除了单细胞真核生物其余真核生物主要帽子形式。在高等生物中，假如第一个核苷酸是A，则在AN6位上还有一个甲基化。在有些真核生物中，在第二个核苷酸2’-O位上还能够再甲基化，组成帽子2，其符号为m7GpppXmpYm。第4页第4页第5页第5页mRNA5’帽子结构是由一系列酶催化。其中RNA鸟氨酸基转移酶称为戴帽酶。甲基供体都为S-腺苷甲硫氨酸（SAM），失去甲基后变为S-腺苷高半胱氨酸。第6页第6页帽子结构功效（1）帽子结构为核糖体对与mRNA辨认提供了信号。帽子0部分结构，包括5‘端鸟嘌呤核苷酸，Ｎ－７甲基和５’－５’三磷酸二酯键，是核糖体辨认所必须；帽子１和２结构中甲基化也能够增进核糖体对ｍRNA结合，但并非决定性。Ｎ－７甲基作用是引入一个正电荷而不是甲基本身，用乙基代替甲基能同样增进核糖体结合。缺乏5’帽子mRNA，不能进行有效翻译。第7页第7页（2）帽子结构增长mRNA稳定性，保护mRNA免遭5’外切核酸酶作用。（3）引起作用。外加带有帽子结构RNA能增进流感病毒RNA（+）链合成。并且帽子结构和开始12~15个核苷酸还共价结合于新合成RNA（+）链5’端。帽子1或帽子2结构对于这种引起是必须。第8页第8页二、多聚（A）尾巴大多数真核生物mRNA都含有3’末端多聚A尾巴。记为poly（A）+。多聚A尾巴大约为200b。多聚A尾巴不是由DNA编码，而是由一个分子量为300KDaRNA末端腺苷酸转移酶（又称为poly（A）聚合酶）催化，以ATP为前体，一个一个地聚合到mRNA3’末端。第9页第9页poly（A）尾巴并不是加在转录中断3’末端，而是在转录产物3’末端由一个分子量为360KDa特异酶作用切除一段。此酶能辨认切点上游方向13~20碱基附近序列AAUAAA及切点下游方向GUGUGUG，然后再由poly（A）聚合酶催化加上poly（A）尾巴。如U突变为G，则切除作用和聚合作用均明显减少。第10页第10页第11页第11页第七节转录后处理（二）

基因间序列清除——稳定RNA从多基因转录产物中分离第12页第12页一、不稳定RNA与稳定RNA在原核生物中，多基因mRNA生成后，绝大部分直接作为模板去翻译各个基因所编码蛋白质，并以此为手段协调相关基因表示量。原核生物mRNA寿命很短，其半衰期常为几分钟。这与原核生物调控机制是相关，当一个蛋白质不再需要时，只要简朴地关闭其mRNA合成就行。第13页第13页在真核生物中，可能有尤其机制来延长需要翻译mRNA寿命，而缩短不再需要mRNA寿命。rRNA和tRNA则不同，它们不是翻译模板，而是蛋白质合成机器组成部分。不论在原核生物中还是真核生物中，都很稳定，普通半衰期为几个小时。第14页第14页rRNA和tRNA与mRNA不同：（1）rRNA和tRNA分子5’端都是单磷酸，而不是三磷酸；（2）rRNA和tRNA分子都比原始转录产物小，即比对应DNA小；（3）全部tRNA都含有原始转录产物中没有异常碱基。因此都需要做转录处理，以删除基因间序列及基因内介入序列。第15页第15页二、rRNA转录后处理原核生物以E.coli为例：其有三种rRNA，即5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA，它们分别含有120、1541和2904个核苷酸。其特点：（1）与tRNA基因混杂在一个操纵元中；大肠杆菌有7个这样操纵元。其中rRNA基因在各操纵元中相对位置都相同，即16SrDNA，间隔tDNA，23SrDNA，5SrDNA，收尾tDNA；但tDNA在各操纵元数量、种类和位置都不相同。（2）这7个操纵元大多数都集中在复制原点两侧附近，其转录方向与DNA复制方向相同。第16页第16页当rrn操纵元转录产生一个多基因30SRNA后，必须切除先导序列、拖尾序列和基因间序列。这些工作都有RNAaseⅢ完毕。其特点：必须作用于双链RNA，在两条链切点通常是错开两个碱基对。第17页第17页第18页第18页真核生物有四种rRNA，即5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA和5SrRNA。前三者基因构成一个转录元，产生45S前体RNA。第19页第19页第20页第20页三、tRNA转录后处理原核生物tRNA基因转录单元大多数是多基因。同一个tRNA几个基因拷贝能够转录在一条RNA中，不同tRNA也能够转录在一条RNA中，还有tRNA与rRNA组成转录单元。第21页第21页以大肠杆菌tRNATyr1为例。它携带酪氨酸tRNA，辨认密码子为GAU。这个分子含有85个核苷酸，在大肠杆菌DNA中有两个基因拷贝，每个基因是350个核苷酸，两个基因间有一段200bP间隔子。两个基因转录成一条RNA。第22页第22页tRNATyr1转录后处理过程主要有五步（1）一个能辨认发卡结构Ⅰ内切核酸酶在箭头所指处切断；（2）RNAaseD辨认CCA末端，一个一个切除7个核苷酸。生成分子称为前tRNA。（3）RNAaseP在箭头所指处切断，负责

5’- P末端处理；（4）RNAaseD除去

3’末端二个核苷酸。（5）有6个碱基通过专一性酶处理变为异常碱基。第23页第23页tRNA加工酶主要包括tRNA核苷酸转移酶，RNAaseP、RNAaseD、RNAaseⅢ及RNAaseP4。（1）tRNA核苷酸转移酶：能特异地以ATP和CTP为前体催化tRNA3’末端CCA生成。tRNA基因有两种类型，一个是有CCA序列（Ⅰ型），一个是没有CCA序列（Ⅱ型）。成熟有功效tRNA都有CCA3’-OH末端，这是tRNA结合并携带氨基酸功效所必须。第24页第24页原核生物tRNA绝大多数为Ⅰ型，少数噬菌体为Ⅱ型；真核生物均为Ⅱ型。tRNA核苷酸转移酶反应是专一，当tRNA缺乏CCA末端时，总是生成CCA末端。此酶没有种族特异性，不同种类酶与tRNA配合都能添加CCA末端。第25页第25页（2）RNAaseP：是一个内切酶。全部tRNA5’末端都由该酶产生。大肠杆菌RNAaseP温度敏感突变体在非许可温度时使40各种tRNA前体发生积累。该酶是一个核蛋白，由两部分组成。这两部分在不同物种之间是非常保守。各种tRNA前体分子与RNAaseP反应，都能取得该tRNA正确5’端序列。RNAaseP识别tRNA空间构象，而不是几个核苷酸序列。各种tRNA都有其保守核苷酸，以维持tRNA空间构象。第26页第26页（3）RNAaseD

：为外切核酸酶。作用于tRNA3’末端多出核苷酸，直到CCA序列为止。其作用是一个一个CCA外围切除核苷酸。第27页第27页第八节转录后处理（三）

内元清除——RNA拼接第28页第28页RNA拼接机制研究，是80年代生物化学和分子生物学领域中最有气愤课题之一。它不但处理了不连续基因转录产物拼接问题，并且对理解不连续基因起源及整个生命起源与进化问题都是有力推动。核酸分子催化功效发觉拓宽了人们对酶结识。第29页第29页内元分为四类（1）Ⅰ类内元：由四个10~12bp保守序列及其构成二级结构；这类内元分布比较广。（2）Ⅱ类内元：不具备保守序列和其二级结构。（3）Ⅲ类内元：指核基因mRNA前体中内元，snRNA参与拼接机制。（4）Ⅳ类内元：tRNA前体拼接。第30页第30页一、tRNA拼接在酵母约400个核Trnajyin中有40个是不连续基因，每一个都含有一个内元，位于反密码子3’方向且与反密码子毗邻。内元长度为14~45bp。携带同一个氨基酸各种tRNA中内元序列是相关，而不同氨基酸tRNA内元序列是不相关。第31页第31页tRNA基因内元没有为拼接酶系所辨认一致序列。因此，在拼接之前前体中反密码子总是处于双链RNA状态，从而受到保护而不致为拼接酶所破坏。这部分双链使得反密码子噜噗柄部比成熟tRNA反密码子噜噗柄部长得多。而三叶草结构其余部分与成熟tRNA完全同样。因此，

拼接酶系辨认是共同二级结构，而不是保守序列。第32页第32页体外试验发觉tRNA拼接环节：由一个内切酶所催化两个磷酸二酯键断裂，释放出一条线状内元分子和两个互相由二级结构作用力连接在一起“tRNA半分子”。这一步反应不需要ATP。tRNA半分子不久采用成熟tRNA分子构象，只但是在反密码子环上留下一个切刻。然后再发生第二步反应，即由RNA连接酶所催化依赖于ATP连接反应。第33页第33页第34页第34页二、Ⅰ类内元拼接Ⅰ类内元特点:(1)拼接点含有序列特性.5’拼接点和3’拼接点大部分序列为U…….G.第35页第35页(2)内元内还含有比较保守四种10~12核苷酸序列，分别以5’-P-Q-R-S-3’表示。P序列能与Q序列互补，R序列能与S序列互补，形成一个中部关键结构。这样，位于内元序列中靠近5’拼接点一段序列就能与两个拼接点边界序列配对，将两个拼接点拉在一起便于磷酸二酯键切断和再连接。内元中能与两个拼接点边界序列配正确一段序列称为内部引导序列（IGS）。第36页第36页第37页第37页用放射性标识鸟嘌呤核苷处理35SRNA，发觉拼接环节：（1）取代转酯反应：G通过正常磷酸二酯键与内元序列5’端相连。这是鸟嘌呤核苷3’-OH攻打第一个外元与内元之间磷酸二酯键结果，同时在第一个外元3’端产生了-OH。（2）取代转酯反应：第一个外元3’-OH攻打第二个外元与内元之间磷酸二酯键，结果两个外元连接起来。而释放出来内元再通过两次转酯反应，释放出15和4核苷酸两个小片段，最后形成稳定线状分子，称为L-19。第38页第38页第39页第39页内元进行两次转酯反应意义也许是使基因拼接不可逆进行下去。整个反应过程都没有蛋白质参与，即拼接这种活性是35SRNA内元本身含有性质，称为本身催化。其特点：催化已有一处磷酸二酯键转变成另一处新磷酸二酯键，且不需要能量。内元既是酶，又是相应底物。只是此酶在反应结束后不再生，而是变成了新分子。因此，内元又称为RNA重排酶或RNA异构酶。第40页第40页RNA催化功效发对于理解生命进化过程有重大意义。很也许在原始生命中，RNA催化断裂-连接反应是最早出现催化过程。依据从遗传信息到蛋白质合成过程中，RNA所表现出多方面作用，人们早就推测RNA是生物体系中最早出现大分子种类。第41页第41页酵母拼接过程中所涉及2’磷酸酯键，是DNA不也许有。因此，RNA催化功效必定出现在DNA成为遗传信息载体之前。即，在原始生命中遗传信息载体是RNA而不是DNA。由于DNA稳定性和空间结构方面某种优势而取代了RNA成为主要遗传物质，并且蛋白质以其侧链多样性和灵活性取代了RNA成为主要催化剂。第42页第42页三、编码RNA成熟酶内元在许多Ⅰ类内，存在着外元和内元联合编码一个蛋白质——RNA成熟酶现象。Ⅱ类内元也发觉了类似情况，如眼虫叶绿体有32KDaRNA成熟酶。

以酵母线粒体细胞色素b基因（cob基因，又称BOX基因）为例，来阐明RNA成熟酶生成和其调整机制。第43页第43页不同酵母含有长短不同cob基因。长基因编码序列为1155bp，整个基因长6400bp，包含6个外元（B1-B6）和5个内元（Ⅰ1-Ⅰ5）。短基因大约是长基因二分之一，包含3个外元和两个内元。第一个外元相称于长基因外元B1-B4，而长基因内元Ⅰ1-Ⅰ3在短基因中消失。长短基因编码一样385氨基酸，含有一样表示能力。第44页第44页RNA成熟酶：cob基因中Ⅰ2-Ⅰ4各编码一个为删除各自内元序列所不可缺乏蛋白质。第45页第45页以内元2所编码RNA成熟酶为例，阐明成熟酶mRNA产生过程：第一个外元B1编码细胞色素bN端139氨基酸（417bp）。第一个内元Ⅰ1756bp，其中三个阅读框均被阻断。B2是一个很小外元，只有14bp。Ⅰ2长1240bp，在其前有一个开放阅读框，与B1+B2阅读框完全一致。这样，当Ⅰ1被除去时，B1、B2和Ⅰ2及其以后部分就连接在一起，成为一个较短mRNA前体。这样，从B1AUG密码子开始，共有144+280=424个密码子，能翻译产生一个423个氨基酸RNA成熟酶。其前144个氨基酸与细胞色素bN端144个氨基酸完全相同，而其余279个氨基酸则由Ⅰ2编码。第46页第46页当Ⅰ2清除之后，B1、B2和B3互相衔接起来，不再产生清除Ⅰ2这个RNA成熟酶。正是由于RNA成熟酶造成合成本身能力丧失，因此细胞内RNA成熟酶含量极低。也阐明RNA成熟酶构成了一个自动调整负反馈网络。正是这个负反馈网络阐明RNA成熟酶只作用其相应内元拼接过程，对其它内元拼接不起作用。第47页第47页四、Ⅱ类内元拼接Ⅱ类内元除了前提到两个拼接点序列特性外，在其3’末端尚有特性序列（1）离开3；拼接点6~12bp序列比较保守，一致序列为PyPuPyPyTA*Py，其中A*为100%保守一个核苷酸。（2）在上述7核苷酸序列中间和两侧各有一段3~5核苷酸短序列能与上游方向核苷酸互补；而保守A*总是不包括在这些互补序列之中。即，在形成部分双链结构中，保守A*总是不在双链部分，而是向外突出“芽状物”之中。第48页第48页体外试验：将细胞色素c氧化酶亚基内元15γ克隆到包含SP6开启子质粒pKM2中，可得到大量包含此内元RNA转录产物。这种产物有体外自我拼接能力，但与Ⅰ类内元有所不同：不需要带有3’-OH鸟核苷（酸），也不需要一价阳离子，仅需要5mM左右Mg++和少许亚精胺；如增加Mg++浓度，能够不需要亚精胺。反应最适温度约45℃。第49页第49页切下来内元呈套索状，由2’，5’-磷酸二酯键连接成环形。套索状产物能够HELA细胞提取液（含有去分枝酶）处理可变为线形分子。以套索状产物为模板进行反转录，则在分枝处快速终止反应。由于套索状结构含有自由3’-OH末端，因此能够用与套索互补单链DNA为模板，以套索为引物合成DNA链。两种反应都能够用RNAaseⅠ切除套索结构而终止反应。第50页第50页Ⅱ类内元拼接反应也是转酯作用，发动第一个转酯反应正是保守A*。A以其2’-OH发动亲核袭击；保守A不参与二级结构碱基配对，确保了它发动转酯反应功效。第51页第51页五、核基因mRNA拼接核基因mRNA内元拼接点序列很简朴，均为CU…….AG。在内元3’末端，也有一个核苷酸序列，其一致序列是PyXPyTPuA*Py。这两个保守序列突变就不能正确拼接mRNA前体，但仅靠这样简朴保守序列是不也许确保正确拼接，snRNA参与了这一辨认过程。第52页第52页真核生物细胞中，有105~106个100~300bP小分子RNA。它们有是RNA聚合酶Ⅲ转录，有是RNA聚合酶Ⅱ转录，其中有还像mRNA同样戴上帽子。在核中小RNA称为snRNA，在细胞质中称为scRNA。普通情况下，它们多以核蛋白形式存在，即snRNP和scRNP。第53页第53页各种snRNA之间有序列共同性，造成各种sNRNP也也许有共同蛋白质亚基，因此一个sNRNP抗体能辨认许各种snRNP。除了共同蛋白质亚基形成关键颗粒外，每一个snRNP尚有各自辅助蛋白因子。第54页第54页在各种snRNA中，只有U1sNRNA5’端序列能够与mRNA前体两个拼接点序列互补。U1snRNA已发觉于哺乳动物，鸟类，昆虫细胞中。人类U1snRNA中除了RNA外，还含有8个蛋白质亚基。其5’末端11个核苷酸呈单链状态，因此能与拼接点序列互补。第55页第55页第56页第56页snRNA与拼接点配对情况模式如图。上图表示snRNA与内元互相结合总体结构；下图为一个典型内元序列与snRNA碱基配对情况。对于大多数内元来说，其左拼接点有4~6碱基配对，其右拼接点只有两个碱基配对。第57页第57页与拼接点结合是整个U1snRNP性质，提纯snRNA不能与拼接点结合。UIsnRNA与其它蛋白质也许构成一个复杂拼接体，U1snRNA只有在这样一个复合体中才干辨认拼接点序列。当前还发觉了其它种类snRNP：U2snRNP、U5snRNP、U4/U6snRNP。迄今没有发觉这些小RNA含有酶活性。第58页第58页第十节逆转录第59页第59页逆转录酶是1960年由Temin等人发觉，在研究鸟类路斯氏肉瘤病毒时发觉了一个依赖于RNADNA聚合酶。发觉了各种高等真核生物RNA肿瘤病毒都有逆转录酶，这些RNA病毒统称为还原病毒。全部还原病毒都有三个基因，一个为gag，编码病毒种族特异性抗原；一个是pol，编码逆转录酶；一个是env，编码病毒外膜蛋白。这三个基因只是指其编码序列，而实际上经过不同转录和翻译后处理能够产生不同蛋白质。第60页第60页逆转录病毒基因组为RNA，普通称为正链病毒。逆转录酶负责使病毒RNA基因组（正链RNA）转化为互补DNA链，这个过程称为逆转录。合成DNA链称为负链DNA。以负链DNA为模板合成新DNA链称为正链DNA。第61页第61页逆转录与转录区别1过程和产物完全相反。2逆转录酶与RNA聚合酶完全不同。（1）从本质上说逆转录酶属于DNA聚合酶，其前体为dNTP，产物为DNA链；（2）必须有引物存在下才干起始聚合；（3）逆转录酶是金属蛋白，需要Zn++激活。3目标不同：转录在于制造基因产物RNA或DNA；还原病毒直接目标在于基因组重组。第62页第62页正是由于逆转录酶和逆转录作用发觉，才使中心法则得到补充和完善。1957年Crick提出了中心法测(centraldogma)DNA→RNA→蛋白质DNARNA蛋白质第63页第63页逆转录酶是一类非常复杂酶，在其简朴一条肽链上含有各种酶活性。主要酶活性有DNA聚合酶活性、RNAaseH活性，DNA内切酶活性，DNA旋转酶活性，螺旋酶活性及tRNA结合活性。第64页第64页1DNA聚合酶活性：逆转录酶有双重活性，既有RNA指导DNA聚合酶活性，又有DNA指导DNA聚合酶活性。因此，此酶能以RNA和DNA为模板，在引物存在下合成DNA。发觉，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ也能以RNA为模板拷贝出DNA链。第65页第65页还原病毒逆转录酶与DNA聚合酶

区别（1）利用不同模板——引物体系来区分。逆转录酶能利用（Cm）n（dG）15-进行有效DNA合成而不能利用（dT）n（A）15-和（Da）（dT）15-；而DNA聚合酶恰恰相反。（2）逆转录酶不具备3’5’和5’3’外切酶活性，且逆转录没保真度比原核和真核生物DNA聚合酶低得多，错配几率比它们高1~3个数量级。这也是各种RNA肿瘤病毒含有很高自发突变原因。第66页第66页2RNAaseH活性：还原病毒要将自己单链RNA分子转变为双链DNA分子才干整合到寄主染色体中。要完毕这种转变，就必须有降解RNA酶。因此，所有逆转录酶都有RNAaseH活性。但逆转录酶只有外切酶活性，而无内切酶活性，因此作用较慢。第67页第67页3DNA内切酶活性：所有逆转录酶都有一定DNA内切酶活性，这种酶含有位点特异性。但有Mn++存在时，则失去位点特异性，成为对超螺旋更为敏感切刻酶活性。也许与重组功效相关。第68页第68页4DNA旋转酶活性：报道ASV病毒粒子有DNA旋转酶活性，能使Ⅰ型DNA变为Ⅰ0型。5螺旋酶活性：病毒AMV逆转录酶αβ和α都含有旋转酶活性。6tRNA结合活性：所有逆转录酶都含有与其引物tRNA结合能力。

第69页第69页逆转录酶生物活性1RNA指导DNA聚合酶，能够利用病毒RNA为模板合成一条互补DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；2DNA指导DNA聚合酶，以新形成DNA链为模板，合成另一条互补DNA链，形成双链DNA分子；3RNAaseH活性，指除去杂合分子中RNA，能够从两个方向水解DNA-RNA。第70页第70页EndEnd第71页第71页以四膜虫大rRNA前体分子拼接为例，阐明Ⅰ类内元拼接分子机制四膜虫特点:微核——二倍体基因组保留在微核中；大核——基因扩增发生在大核。在大核，rDNA扩增产生了大量染色体外线状分子，每个分子都是回纹序列二聚体。二聚体含两个完全相同转录单元，转录成35SrRNA前体。含有内元26SrRNA位于这个前体3’端。第72页第72页将分离但大核进行保温，35SRNA释放出413核苷酸长线状RNA单链，即内元序列，没有游离外元出现。如延长保温