生态毒理赵蕴琛 6 实验六

14生态赵蕴琛实验六硫氰酸钠对斑马鱼的蓄积毒性实验2016年12月2日姓名赵蕴琛指导老师肖慧专业年级生态学2014级学目硫氰酸钠对斑马鱼的蓄积毒性实验同组者张子良张培春张婉捷实验目的1、了解蓄积毒性实验方法2、评价硫氰酸钠对斑马鱼的蓄积作用强度。实验原理蓄积毒性作用(cumulativecoefficientaction)是当低于中毒剂量的环境毒物或外来化合物反复多次的与生物体持续接触，经一定时间后使生物体出现明显的中毒表现。蓄积毒性实验分为：蓄积系数法、20天蓄积试验法和受试物生物半衰期测定法。蓄积系数法(cumulativecoefficientmethod)是一种常用来评价环境污染物蓄积作用的方法。1、蓄积系数法蓄积系数法是一种用来评估毒物和污染物蓄积作用的方法。蓄积系数(comulativecoefficient,K)，是分次给予受试物后引起50％受试动物出现某种毒效应的总剂量(以ED50(n))表示)，与一次给予受试物后引起50％受试动物出现同一毒效应的剂量(以ED50(1)表示)的比值，即K＝ED50(n)/ED50(1)若以死亡为毒效应指标，上式为K越小，受试化合物的蓄积毒性越大。测定方法：固定剂量每天连续染毒法剂量定期递增染毒法（1）固定计量法固定每天染毒剂量为1/20—1/5LD50，连续染毒，直至实验动物半数死亡。如果染毒剂量累计已达5个LD50动物死亡仍末达半数，实验均可告结束，计算蓄积系数，作出评价。（2）递增剂量法先测定LC50，然后对另一组动物每天染毒，以4天为一期，开始给予0.1LC50。以后每期按1.5倍递增剂量，直至动物半数死亡，或实验已达20天，可结束实验，计算系数。剂量定期递增染毒法的染毒剂量染毒时间/天每日染毒剂量/mg/L每四天染毒总剂量/mg/L累计染毒总剂量/mg/L1-40.100.400.405-80.150.601.009-120.220.881.8813-160.341.363.2417-200.502.005.24注：表中的递增染毒剂量为ED50或LD502、20天蓄积试验法按LD50的1/20、1/10、1/5、1/2及0（溶剂对照）随机分成5组。每天对动物进行染毒，连续20d，各组总剂量分别为1LD50、2LD50、4LD50、10LD50。观察停药后7d内的死亡情况：各剂量组均无死亡,蓄积不明显；如1/20LD50组无死亡，各剂量组死亡也无剂量-反应关系，可认为无明显蓄积毒性；如1/20LD50组无死亡，但各剂量组死亡呈剂量-反应关系，表明有中等蓄积毒性；如1/20LD50组已出现死亡，且各剂量组动物死亡呈剂量-反应关系，则受试动物有强蓄积毒性。3、受试物生物半衰期测定法生物半衰期(T1/2)是指一种外来化合物在体内消除到原有浓度的50％所需要的时间。生物半衰期越长的物质，表示越不易由生物体内消除，其蓄积作用的可能性就越大。因测定生物半衰期过程较为复杂，实际观测中常常以间接测定受试物在血液、尿液或器官组织中原有浓度降低一半所需要的时间，以代表受试物的生物半衰期。其方法是生物体接触受试物后，在一定间隔时间内分别测定血液或尿液、器官组织中受试物的浓度，依据所得结果，按下式求出它的生物半衰期。T1/2=(t1-t2)log2／(logy1-logy2)y1和y2分别为t1和t2时间测得生物体内受试物的浓度或量。根据测得的生物半衰期的长短，可以判定受试物质的蓄积作用。越长，蓄积作用越大，反之则越小。实验材料与仪器斑马鱼、硫氰酸钠、鱼缸、渔具、鱼食、加热泵、加氧泵、温度计等实验步骤1、正式试验前将斑马鱼在与试验相同的环境条件下驯养7~14d，驯养期间斑马鱼死亡率<5%。驯养时每天喂食1次，曝气充氧，正式试验前24h停止喂食。实验开始时，每4天喂食一次。

2、采用固定剂量每天连续染毒法，按LD50的1/20、1/10、1/5、1/2及0(溶剂对照)随机分成5组，每天对动物进行染毒，连续20d。本次采用20天蓄积试验法，LD50=380mg/L表1：硫氰酸钠每天染毒剂量实验结果1、实验结果表2：三点半组实验结果组别天数对照组1/20LD501/10LD501/10LD501/5LD501/2LD50第一天000000第二天000000第三天100001第四天000001第五天000004总和100006在1/2LD50组死亡斑马鱼数目达到本组实验鱼数目一半时，对照组以及其他4个实验组实验剂量均未达到1LD50，对斑马鱼不会造成死亡影响。所以，只对两组1/2LD50数据进行进一步分析。表3：两个1/2LD50组别斑马鱼死亡率硫氰酸钠浓度（mg/L）1903805707609501点半组斑马鱼死亡率（％）002030803点半组斑马鱼死亡率（％）00102060平均斑马鱼死亡率（％）00152570评价硫氰酸钠对斑马鱼的蓄积作用强度。由y=0.0002x2-0.1049x+15（R2=0.9725）得当y=50％时，x=872.857mg/LK=LD50（n）/LD50（1）=872.857mg/L/380mg/L=2.30所以，硫氰酸钠的蓄积毒性为明显蓄积。实验分析硫氰酸钠对斑马鱼造成影响实验结果分析运用同一采购的斑马鱼进行此次的蓄积毒性的检验，可以看出斑马鱼死亡较快，对照组以及其他三个实验组硫氰酸钠添加量均未达到1LD50。将1点半组1/2LD50实验结果和3点半组1/2LD50实验结果去平均后进行分析，可以得出结论，硫氰酸钠对斑马鱼的影响为低毒性。在进行硫氰酸钠对斑马鱼急性毒性实验中，实验结果表明LD50=380mg/L，而此次进行的20天蓄积毒性的监测中，硫氰酸钠对斑马鱼的影响为低毒性的。可能是硫氰酸钠对斑马鱼的存活的影响在一定浓度之间达到急增的效果，而此次实验的浓度设置范围较为宽，并且自身的学识水平没有达到，没有办法准确的推测出硫氰酸钠对斑马鱼造成影响的机理。实验结果误差分析本实验采用的是20天蓄积实验法对斑马鱼进行染毒，在计算硫氰酸钠添加量时虽争议较大，但最后得出合理的药品添加量。对实验本身涞水，能够较好的反应出硫氰酸钠对斑马鱼的蓄积毒性效应。但由于投放毒物量的称取、喂食的量、环境温度湿度的不同，会造成一定的实验误差。每天的投毒工作由不同的同学完成，剂量添加上有误差无法很好避免。1点半组和3点半组两组斑马鱼不同，1点半组斑马鱼生长环境未添加硫氰酸钠，而3点半组斑马鱼为实验后存余。实验对象本身会对实验结果造成实验误差。硫氰酸钠对斑马鱼造成死亡的原因硫氰酸钠通过影响线粒体内膜上含有的大量ATPase,间接激活细胞膜上Na+-Ca2+交换蛋白，从而导致过多的Ca2+进入细胞。谢文平等人(2009)认为,线粒体是易受损伤的敏感细胞器,与鱼的疾病、衰老、细胞凋亡均密切相关。而线粒体内膜上含有大量的ATPase,它的活性对细胞内Ca2+转运起重要作用。Na+/K+-ATP酶、钙ATP酶活性的降低,必然导致细胞内Na+、Ca2+超载。同时,因Na+/K+-ATP酶活性下降会引起胞内Na+超载,后者又会激活细胞膜上Na+-Ca2+交换蛋白,而使过多的Ca2+进入胞内。并且,从亚细胞的角度看,Na+超载还会引起线粒体中Ca2+释放,最终导致胞内Ca2+超载。而Ca2+不仅是神经冲动的必要物质,同时也是细胞信号转导的重要物质。根据实验结果可知,当处理浓度高于安全浓度(1/10LC50)后,脑组织内Na+/K+-ATP酶的活性升高,可能导致细胞胞浆内Ca2+浓度降低。硫氰酸钠通过影响斑马鱼体内的线粒体的活动，导致斑马鱼的死亡。硫氰酸钠的毒性分析及其检测是一种有毒化工原料，国家禁止在食品加工中添加和使用硫氰酸钠。不法商贩将其添加于乳及乳制