固定化木瓜蛋白酶与溶液酶性质的比较1

/固定化木瓜蛋白酶与溶液酶性质的比较学生姓名刘晶指导老师万善霞摘要：本文就木瓜蛋白酶固定化后的性质与其溶液酶性质进行了初步比较。以变性的卵清蛋白为载体，以戊二醛做交联剂固定木瓜蛋白酶。结果表明:与溶液酶相比，固定化后的木瓜蛋白酶最适反应温度提高了30℃，最适反应PH向碱性方向移动2.0，其热稳定性及耐热性均较溶液酶有显著提高关键词：木瓜蛋白酶；固定化;卵清蛋白；戊二醛ComparisｏnoftheprｏpeｒｔiesｉｍｍobiｌizeｄpａpainandsolｕbｌｅpaｐａinLiuJinｇWanＳｈanxｉaＡbstrａcｔ:Ｉnthispａｐeｒ,theiｍmobｉｌiｚeｄpaｐａｉnｗiththenatureofaｐｒeliｍinarｙｎaｔureoｆthｅsolｕbleｐａpaｉncｏｍpared。Toｄｅnaturedeggwhiteproteinastｈeｓuppoｒtwiｔhgluｔａｒaldeｈydeaｓthｅcrosｓ-liｎｋer.Theresultsｈowｅｄthａｔ:coｍpａｒｅdwithｔhesolublepapａｉn，ｉmmobiliｚeｄpａpainｉncｒｅasｅdtｈeoｐtimumｔemperａturｅ30℃，optimｕｍPH2.0ｔotｈeｂasicdｉrｅcｔion,ThｅthｅrmｏstａbｉliｔyanｄthermotolｅraｎceoftｈeｉmmobilizeｄpapainareｏｂviｏuslｙincreasedｃomparｅdtoｔhoseofthｅsolｕbｌeKeyｗｏrds:papain；ｉmmoｂilｉｚatiｏｎ;egｇｗhiteproｔein;glutaralｄehyde目录ＴOC\ｏ"１-3"\h＼ｚ\ｕHYPERＬIＮK＼l”＿Toc19９24１76６"１.序言‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥5HＹPＥＲＬINK＼l”＿Toｃ19９２41767"2。实验材料‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥5HYPERＬINK\l＂_Ｔｏc1992４1768”2．1仪器及器材‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥5HYPERLＩNＫ\l＂_Tｏｃ1992４1769"2。2实验试剂‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥6ＨYPERＬINK\l”_Ｔoc199241774”3。实验方法及结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥6HYPERLINK\ｌ"_Toc1９924177５"3。1实验测定原理 6HＹＰERLINK＼l"_Ｔoc1992４17７６"3.2固定化酶与溶液酶最适温度的比较ﻩ７HYPEＲLINK\ｌ”＿Tｏc１992４１7７７"3．2。１实验方法ﻩ7３。2。1。１试剂组成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥73。2。1。２木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥73.２．1。３木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7３。2.1。4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥8HYＰERLINK\l”_Toｃ199２41778＂３.2.2实验结果及分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥9３。2．２。１实验结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥９3．2.２．2结果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥10ＨＹPERLINK\l"_Ｔoc199２41779＂3.３固定化酶与溶液酶最适PＨ的比较ﻩ１0HＹPＥRLIＮK\ｌ"＿Toc1９9241777＂3．3．1实验方法 103．3．１．１试剂组成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥１03.3。１。2木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥113。3。1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥113．3．１.4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥11HYＰEＲLINK3.4．1试验方法ﻩ123。４.1．１试剂组成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥1２3．4。1。2木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥123．４.1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥133.４。1．4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥14HＹPＥＲLINK\l＂_Toｃ199２4１７８4”3．4．2实验结果及分析 １43。4.2.1实验结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥14３.4.２。２结果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥15HYPERLINK\l”_Ｔoc1９9241785＂3．５固定化酶与溶液酶耐热性的比较 １5HYPEＲＬＩNK\l＂＿Ｔoc１99２4１7８6＂３.５．1试验方法 1５３。５．1.1试剂组成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥１53．5。1。２木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥153。5.1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥153．5。1.4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥16ＨYＰＥRLＩNK＼l"_Toc１9９241787"３.5．2实验结果及分析 16３．５。2。１实验结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥1６3。5.2.２结果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥１6ＨＹPERＬINK4.讨论ﻩ17HＹPERＬINK\l"_Tｏc１9９２41798”5。结论ﻩ17HYPERＬINＫ＼l"_Toc199241７９9”参考文献ﻩ１8HＹＰEＲLINK\ｌ”＿Tｏc1９9241８00＂致谢ﻩ１91.序言木瓜蛋白酶（Papａin）简称木瓜酶,又称为木瓜酵素。木瓜蛋白酶由２12个氨基酸残基组成，并含有3对二硫键，是一种含疏基（—SＨ）肽链的内切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性,具有较广泛的特异性［1］.它的三维结构是由两个不同的结构域所组成，两个结构域之间形成一个缝隙；缝隙内含有酶的活性位点,包括一个催化三联体,与胰凝乳蛋白酶中所含的相似。木瓜蛋白酶中的催化三联体由25位的半胱氨酸(Ｃys-２5）、1５9位的组氨酸（Hiｓ—１5９）和1５8位的天冬酰胺（Aｓn-158）这三个氨基酸所组成[２]。木瓜蛋白酶是一种重要的生化产品，它已被广泛应用于食品、美容化妆品、医药保健品、日化品、饲料、皮革、纺织等多个行业，有效提高产品的质量和档次，降低生产成本。木瓜蛋白酶的固定化始于20世纪60年代初，但多数方法不是因为材料来源困难，就是因为试剂毒性较大而影响了其在工业上应用。Kaｍata［3]曾报道过廉价的卵清蛋白做载体来固定化胰蛋白酶和α—淀粉酶。但这种方法操作相对繁琐,必需先对卵清蛋白进行糖基化,再将糖基化后的载体与酶进行固定，并且糖基化后的载体容易溶解，从而导致固体化酶的回收率偏低。本文以此为基础，载体直接选用变性的卵清蛋白，结合传统的交联固定法,用戊二醛做交联剂,成功的固定了木瓜蛋白酶，简化了操作步骤。用卵清蛋白固定化的木瓜蛋白酶在耐热性、热稳定性、耐酸碱等方面都较溶液酶有明显提高。这为木瓜蛋白酶的固定和提供一种新的途径，为扩大其在工业中的应用提供了一定技术依据。2.实验材料2。1仪器及器材ＵV-21０0型紫外分光光度仪Saｒtｏrius电子分析天平三温三孔水浴锅HZQ－C型空气浴震荡仪海尔4℃移液枪DNP－9０52型电热恒温培养箱WG-71型电热恒温鼓风干燥箱PＨ综合测试仪试管和试管架；烧杯；玻璃棒;量筒；漏斗；研钵；200ml离心管;１50ｍl离心管；石英比色皿;移液枪枪头;2。２试剂木瓜蛋白酶（０.5—２uｎiｔs/ｍg）半胱氨酸乙二胺四乙酸EＤTA硫酸氢二钠（分析纯)磷酸二氢钠(分析纯)戊二醛２5％（生化试剂)氢氧化钠(分析纯)干酪素(棕色瓶子保存)三氯乙酸（TCＡ)3实验方法及结果3.1实验测定原理本试验采用以酪蛋白为底物的紫外分光光度法测定木瓜蛋白酶的活性。木瓜蛋白酶分解酪蛋白的产物为酪氨酸共轭双键，在２80nm处，检测酪氨酸共轭双键的吸光系数,酶的单位定义为每分钟吸光值增加0.０１所需的酶量。对于木瓜蛋白酶的固定，则用变性的卵清蛋白直接作为载体,结合传统的交联固定法，用戊二醛作交联剂,形成共价键,成功地固定了木瓜蛋白酶,主要是基于经济效益和安全两个方面的考虑。首先，卵清蛋白体的获得及制备十分容易,且成本低。另外，在食品和医药的用用中，卵清蛋白载体无毒性问题,这是产品的安全性大大提高；戊二醛又最常用的交联剂之一,交联效果稳定,并且简化了操作步骤。因此,这种固定化木瓜蛋白酶的方法可取。3.2固定化酶溶液酶最适温度的比较3．2。１实验方法3．2.１.1试剂组成木瓜蛋白酶1.６mｇ/mｌ酪蛋白5ｍg/mｌ三氯乙酸１５％戊二醛5%磷酸缓冲液（0。2ｍol/L的pH7。0的磷酸缓冲液中含30mmol/L半胱氨酸和0.6mｍｏl／LＥDTA,)3.2。１.2木瓜蛋白酶的固定化参考相关文献可知［４］，以卵清蛋白为载体固定化木瓜蛋白酶的最佳条件.取定量的鸡蛋清,按１∶3的比例加入蒸馏水，于100℃水浴搅拌加热使其变性成胶状，于电热恒温鼓风干燥箱烘干，研细,以此作为载体。取1g的载体,加入１０mｇ的木瓜蛋白酶,随后加入pＨ６的磷酸缓冲液及5％戊二醛溶液,用电热恒温培养箱混匀，振荡20小时，过滤，将固定后的酶用pH63.2。１.３木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测称取0．１6g木瓜蛋白酶(０。5—2unｉts/ｍｇ),溶于０.2ｍol／Ｌ、ｐH7.０的磷酸缓冲液并定容至100mL,过滤，制得1.6mg／ｍl的木瓜蛋白酶溶液，用比色法测定酶活力.在0。1mL1。6mg/mL的木瓜蛋白酶溶液中加入0.9mＬ磷酸缓冲液（0.2ｍol／Ｌ的pH7。０的磷酸缓冲液中含30mmｏｌ／L半胱氨酸和0.６ｍmol/LEDＴA,现配现用），分别于30℃、４0℃、50℃、6０℃、70℃、80℃、９0℃、100℃水浴恒温10ｍin，加入相应温度恒温预热的5mg/mL的酪蛋白溶液1mＬ（0.2ｍol/LｐH7.０的磷酸缓冲液配制）,相应温度下准确反应１０mｉn，立即加入15%三氯乙酸(ＴCA）溶液3mL终止反应,对照则先加TCＡ终止反应,再加5mｇ/mL的酪蛋白溶液1ｍL，其余与测定管相同.表1木瓜蛋白酶溶液酶加样顺序管号0（对照）1(样品）２（样品)酶液（ml）0.10。10。1激活剂（ml）1。01．０１.0恒温预热10分钟酪蛋白(ml）０1。０1．０恒温水浴10分钟15％TCA（ｍl）3。03．0３．０酪蛋白（ml）１。００0摇匀，静置１０分钟过滤ＯＤ2８0nm０。0０0３。2.１。4固定化酶活力的测定在试管中加入1。0mＬ0.1mｏｌ/L，pＨ７。0的磷酸盐缓冲溶液(含3０mｍｏｌ/Ｌ半胱氨酸和０。6mｍol/LＥＤTＡ,)，分别于30℃、4０℃、５0℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃预热5mｉn,加入0.01g的固定化酶，随后加入1．0ｍL酪蛋白溶液。于相应温度水浴中震荡反应,10min后立即加入３表２木瓜蛋白酶溶液酶加样顺序管号０（对照）1（样品)2(样品）激活剂(ml）1．01．０1。0恒温预热5分钟固定化酶（ｇ）0.010。0１0.０1酪蛋白（ml)0１．０1．0恒温水浴1０分钟1５％TCＡ(ml）3．03。０３。0酪蛋白(ml）1.０00摇匀，25℃OＤ280nｍ０.００03。2。2实验结果及分析3．2.2．1实验结果表３不同温度下，固定化木瓜蛋白酶与其溶液酶活性酶酶组温度溶液酶固定化酶第一组第二组第三组平均值第一组第二组第三组平均值30０．0１10．００90。０120．0１10.0090.０080。０1００。009400．0500．0470。０470。０480。0１２０.01２0.01０0．01250０。0670。０６7０．0650.0６50．0230.02５0.02４０.02460０.1030.1010.1020.1０20.0３１０．0３30．03２0．0３2７00.