生物信息学课件 12、蛋白质结构测定和分析

第10讲蛋白质结构测定和分析

李少伟

Dec.18th,2013

生物信息学背景Whyproteinstructures?仅仅限于药物研发吗？各种蛋白质原子结构：解释了生命的本质细胞维持基本生命特征适应内外环境进化选择了一套精巧的分子机制细胞是生命的基本单位细胞内几乎每个生物学过程均包含多个蛋白质相互作用细胞：精巧的“生化工厂”蛋白质相互作用细胞器蛋白质/蛋白质组基因/基因组组织/器官及以上层次细胞认识“蛋白质机器及其相互作用模式”是破译生命规律不可或缺的重要层次功能

OK结构?功能?结构?传统的做法现代的做法蛋白质结构测定与功能研究同步进行、甚至先行一步，并非一定在清楚功能的前提下再开展三维结构研究。生物大分子三维结构研究方法：核磁共振波谱学X-射线晶体学低温电镜技术核磁共振波谱学(NMR)测定生物大分子结构重要手段具有不同结构特征的原子核间距、肽键二面角、肽键的动态特性等都具有特征的核磁共振谱线；1H,13C,15N是核磁共振检测的主要对象,各有不同的共振频率,从而形成核磁共振氢谱、碳谱和氮谱三部分；NMR不破坏被测样品的内部结构，是一种无损检测方法。核磁共振谱仪的组成MagnetProbeConsoleComputer1985年,维特里希(KurtWüthrich）等人公布了第一次利用NMR法测定的溶液中蛋白质-蛋白酶抑制剂IIA(proteinaseinhibitorIIA)的结构；目前,科学家已经利用这一方法绘制出15%～20%的已知蛋白质的结构；它已广泛应用于化学、食品、医学、生物学、遗传学等学科领域直接在溶液中测定自然状态下的大分子三维空间结构，其分辨率已接近0.12nm；它只能测量分子量较小(15-25kDa)的生物分子，最大可测定35kDa的生物分子NMR测定结构的特点X－射线晶体学BioinformaticsProteinCrystalSRX-raysourceΦ(hkl)(xyz)Tracing&BuildingFinalStructuralModelInitialStructuralModelStructuralRefinementRawgenomicdata|F(hkl)|DiffractionDataTechnicalRoadmapfromgenetoproteinbySRX-raycrystallographyComputercontrol&dataanalysisGenesequenceProteinstructureBiologicalStoryPhasing&ImprovementComputercontrol&dataanalysisX-射线晶体学X-射线的产生电子被高能设备如X射线发生器或同步加速器从低能轨道激发跃迁到高能轨道后，会自然衰减并回迁到低能级轨道，在电子的减速和回迁过程中发射出X射线。

X-射线发生方法封闭的X射线管旋转阳极X射线管负高亚(negativehightension)阴极(cathode)阳极(anode)X射线X射线铍窗口封闭的X射线管工作原理示意图

真空阴极的热电子在负高压的作用下高速撞击阳极的金属靶，大部分能量转化为热能，小部分能量转换为X射线。发射角(take-offangle)

旋转阳极X射线管的出现主要是为了解决散热问题，使得X射线管的工作功率大大增加。例如：

封闭X射线管：40kV,50mA

旋转阳极X射线管：40kV,200mA同步辐射粒子轨迹(particletrajectory)带电粒子注入系统储存环(storagering)带电粒子（electron或positron）以接近光速的速度在储存环中循环运动。当粒子束被迫改变方向时，被朝着环心加速并发射出电磁波。X-射线发生方法蛋白质晶体

蛋白质晶体内部结构：三维周期重复排列，每个结晶重复单位(分子或复合体)的化学组成与分子构象都是均一的。待结晶的蛋白质分子或复合体OZXY蛋白结晶母液1mm=107埃线性尺度可以包含104-5个分子(分子尺度102-3埃)三维尺度1x1x1mm3可以包含1064-125个分子。晶体的产生—结晶相影响因素：物理因素：温度、压力、震动、溶剂清洁度、试剂纯度、重力、外加物理场等生物化学因素：pH、离子强度、沉淀剂/添加剂的类型和浓度等其他：溶液过饱和度、纯度等XYZ晶体内部结构可以抽象为称为单位晶胞（a,b,c,α,β,γ)的单位平行六面体的密堆积。单位晶胞cba有关结论汇总：对称元素：10，26空间群：230点群：32晶系与晶胞参数类别：7平移群：14空间点阵类别：P，C，I，F。结晶常用方法X-射线与晶体的关系✔只有光源波长与障碍物尺度相当，或者光源波长小于障碍物尺度的时候才能探测到障碍物的信息。衍射和干涉光栅C-C键长：1.5ÅX-射线波长：λ＝0.1Å-100ÅX-射线+晶体原子核核外电子仅考虑核外电子的作用，忽略原子核的作用。蛋白质晶体内部结构抽象为充满了电子云的三维空间。晶体衍射即为以晶胞内电子云为散射体产生的相干次生波的干涉现象X-射线+晶体X-ray360°衍射图：……各种方法获得初始相角并改善其品质电子密度计算Tracing相角问题求解晶体衍射数据修正(xyz)|F(hkl)|最终模型初始模型关键问题：相位解决蛋白质分子结构，即根据蛋白质电子密度构建的分子模型。参考f(x)=Acos(2px–a)上式也可表示为：

r为电子密度，xyz为实空间坐标

V为晶胞体积

|F(hkl)|2=I(hkl)，I代表衍射点的强度，hkl为衍射点坐标

a

代表初始相角hkf(x)=Acos(2px–a)a=0x12340a=p/2x12340a=-px1234000对于一束X-射线f(x)=Acos(2px–a)来说，无论它的初始相角是多少，它在接收屏上所形成的曝光点都是相同的。反之，我们只根据接收屏上的曝光点也是无法得知造成该曝光点的X-射线的初始相角信息的。初始相角无法直接测量得到，但它又是求解电子密度时所必需的信息。这就是X-射线晶体衍射法解析物质结构时所需要解决的核心问题——相位（相角）问题。解决相位问题的方法：

同晶置换法

最原始的方法，包括多对同晶置换法和单对同晶置换法。需要在蛋白质晶体中引入重原子，并且要求引入了重原子的晶体与未引入重原子的晶体的晶型基本相同。解析过程需要未引入重原子、引入了重原子，甚至引入了不同重原子的多颗晶体的多套衍射数据。反常散射法包括多波长反常散射法和单波长反常散射法。通常需要引入具有较强反常散射能力的原子，如硒原子。不需要多颗晶体但往往需要同一颗晶体在不同波长X-射线照射下的多套衍射数据。随着技术的进步，目前蛋白质自身的硫原子也开始被用来作为反常散射源。分子置换法

需要同源性较高的蛋白质分子结构模型，不需要多颗晶体，不需要多套衍射数据，方便快捷，但不能用来解析全新的结构。低温电镜技术透射电子显微镜技术

透射电子显微镜技术是以电子束为光源的显微成像技术，其成像原理与普通光学显微镜基本一样，但电子束的波长比可见或紫外光要短得多，因此其分辨率得到很大的提高，目前TEM的分辨力可达0.2nm。透射电子显微镜技术阀门显示屏电子枪聚光镜系统样品杆c)阀门样品杆显示屏仪器示意图透射电子显微镜技术优点对比度好信噪比高操作简便耐电子辐射不足

由于脱水作用而变形失真由于染色剂的pH和离子强度而变形失真仅显示外围轮廓成像依赖染色的质量周围背景过高分辨率有限CurrProtocProteinSci.2005Dec;Chapter17:Unit17.2负染技术低温透射电子显微镜技术CurrProtocProteinSci.2005Dec;Chapter17:Unit17.2Physiology21:13-18,2006速冻技术优点将样品保留在液相中维持了天然结构高分辨率揭示内部结构不足

设备及操作要求较高信噪比低生物样品为什么需要低温：脂质体负染图脂质体冷冻电镜图为什么需要低温：冷冻超薄切片举例为什么需要低温：冷冻负染举例低温样品制备

Vitrobot-VitrificationRobotIncubationofsuspensionongrid(holeycarbonorQuantifoils)atconstanttemperatureandhumidityAutomatedblottingPlungefreezinginliquidcryogen(ethane,propane)InvestigationinamorphousiceC-filmSuspensionwithmacromoleculesCryo-holderworkstation低温样品转移过程，低于-170°CCryo-holderworkstation低温样品杆FromLake(1972),p.174IntheoryInpracticeCryo-EM

3D

Reconstruction

ofViruses提纯样品图像整合Localizationand)EPUXplore3D断层图像重构单颗粒重构Argos低温电镜三维结构重建速冻样品制备样品预扫描

（负染）低温电镜超微图像采集Inelectronmicroscope2DimagesInourprogram3Dmapincomputer3Dvirusinrealworldcompute3Dmapsfrom2DimagesIcosahedralParticleImageReconstructionSchemeIcosahedralVirus3DReconstructionSchemeDigitizeMicrographSelectImagesCompute3DRMonitorDataQualityDone?EstablishRefinementCriteria:ResolutionLimitsBoxParticlesRefine?NNMoreData?ExpandDataSetYResampleReboxNPre-ProcessImagesArchiveDataVisualize&Interpret3DStructureYDetermineOriginandOrientation(q,f,wx,y)RefinementYRefineCTFInitial3DModelAuto3demDigitizeMicrographHPV58

VLP低温电镜结构重建BoxParticles~1400

micrographs~6000particlesPre-ProcessImagesRemoveblemish,RemoveGradientNormalizemeans/variances,ApodizeDetermineCTFparametersCreateInitialParameterFilesHPV58

VLP低温电镜结构重建SpecifyingDirectionofView:,fOrientationf553ZXY(80,-15)asymetric

unit

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HPV

VLP5parameterstodescribeaboxedparticle: 3rotationalangles:q,fandwindegrees 2translationalparameters:x,yinpixelsDetermineOriginandOrientation(q,f,wx,y)xyCompute3DmapAutomationauto3demGoal:combine“good”HPV58particleimagestocomputea3DdensitymapHPV58

VLP低温电镜结构重建Initial3DModel结构与功能示例(RIG-1)RIG-1RIG-1(retinoicacid-inducibl