多位点复合扩增STR技术在两例人源肿瘤细胞系身份鉴定中的应用

多位点复合扩增STR技术在两例人源肿瘤细胞系身份鉴定中的应用

Summary目的：提取两株人源细胞肿瘤细胞CNE-1和CNE-2的基因组DNA，采用多位点复合扩增STR技术对20个常染色体STR基因座和一个性别决定基因座AMEL进行复合扩增，毛细管电泳后分析两例细胞株的STR型别，使用DSMZ和Cellosurus的STR在线比对数据库进行STR比对，鉴别细胞系的身份。实验结果表明CNE-1和CNE-2彼此之间的匹配率为98.63%；使用DSMZ数据库和Cellosurus对CNE-1和CNE-2细胞系STR比对结果表明它们与HeLa的匹配率分别为91.7%/94.4%和94.44%/95.77%。结论：经STR分型技术鉴定，CNE-1和CNE-2细胞系为同一来源，且与HeLa的STR分型图谱具有高度相似性，说明这两株细胞系已经被HeLa细胞污染。Keys：人源细胞株，细胞身份鉴定，STR技术细胞系作为一种重要的生物模型广泛应用于生命科学和生物医学研究中，选择身份正确的细胞系模型是确保研究结果真实可靠的前提[1,2]。本研究中，我们通过21位点STR分型技术对本实验室保存的两株人肿瘤细胞系CNE-1和CNE-2进行身份鉴定，发现这两株细胞系已经被HeLa细胞污染。我们建议其他实验室在使用CNE-1和CNE-2细胞系进行实验研究前对其进行身份认证，以免使用错误细胞系进行研究导致实验结果的可靠性受到影响。1材料与方法1.1材料实验仪器与试剂台式低速离心机；台式冷冻离心机；细胞培养箱；恒温水浴锅；旋涡振荡仪；倒置显微镜；超净工作台；纯水仪；基因扩增仪；ABI3100遗传分析仪。DMEM培养基、EDTA-胰酶消化液、PBS缓冲溶液等均购自索莱宝；胎牛血清购自BiologicalIndustries。1.2方法1.2.1细胞培养从-80℃冰箱中取出冻存的CNE-1和CNE-2细胞，复苏到一个T25培养瓶后，待细胞汇合度达到80%时弃掉旧完全培养基后用PBS洗涤，加入1mL胰蛋白酶-EDTA消化液进行消化，加入2mL完全培养基终止消化，1,000rpm离心3分钟后收集细胞沉淀。1.2.2基因组DNA的提取和STR扩增及分析提取细胞系基因组DNA并采用STR多重扩增技术对D19S433、D5S818、D13S317、AMEL等共21个STR基因座位点进行PCR扩增反应。将细胞系外检，基因组DNA提取和STR多重扩增按照试剂盒说明书进行。PCR扩增反应体系：2×PCR反应混合液、0.2μM反应引物、1μL待测细胞系基因组DNA、阴性对照（ddH2O）进行PCR扩增，反应体系总体积为25μL。PCR反应参数为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，70℃延伸60秒，共30个循环；60℃延伸30分钟；4℃保存。PCR扩增结束后，加入去离子甲酰胺和内标后取1μL的PCR扩增产物于ABI3100遗传分析仪进行高分子聚合物凝胶电泳并扫描电泳结果，将CNE-1和CNE-2相互比对并分别在DSMZ和Cellosurus在线STR比对数据库进行17位点和20位点STR比对，使用Tanabe公式，即，匹配率=（2×共同峰数）/（参考峰数+待检峰数）×100%。2结果2.1CNE-1和CNE-2的STR分型图谱CNE-1和CNE-2的STR位点信息如图1所示，两者的21个STR位点中只有D18S51位点有一个等位基因不同，其余位点均相同，彼此之间的匹配率为98.63%。根据STR匹配阈值可判断CNE-1和CNE-2细胞系具有相同来源。然而CNE-1是从高分化鳞癌女性患者分离的细胞株，而CNE-2是从低分化鳞癌男性患者分离的细胞株，两者的供体来源不同，其STR图谱不应该会表现出如此高度一致性，可能是这两株细胞系发生了相同的交叉污染。图1：CNE-1细胞系（左）和CNE-2（右）的STR分型图谱2.2DSMZ在线STR比对我们通过DSMZ在线STR数据库将CNE-1和CNE-2与细胞库内的参考细胞系进行17位点STR比对，从而进行身份鉴定。CNE-1比对结果如图2（CNE-2采用相同方法比对），红色方框框出来的为参考细胞系，结果证实CNE-1和CNE-2分别与HeLa细胞系的匹配率为91.7%和94.4%，说明这两株细胞系为HeLa细胞系的替代物。

图2：CNE-1与DSMZ细胞库内参考细胞系的STR比对结果2.3Cellosurus在线STR比对Cellosurus在线STR数据库中可提供包括CSF1PO、D2S1338、D3S1358、D5S818、AMEL等在内的最多32个位点的STR图谱。本研究中检测的21个STR位点均包括在这32个位点中。如图3所示，CNE-1分型与Cellosurus库内STR数据比对（CNE-2采用相同方式比对），比对结果表明CNE-1和CNE-2与HeLa细胞的STR匹配率分别为94.44%和95.77%，证实CNE-1和CNE-2为HeLa细胞污染物。图3：CNE-1与Cellosurus数据库内参考细胞系的STR比对结果3讨论细胞系的交叉污染是指一个细胞系被另外一个细胞系取代的过程，常常由于不规范的实验室操作，比如同时使用两个及以上细胞系、不同细胞系共用培养基、移液管等试剂耗材导致。鼻咽癌高发于我国南部和东南亚地区，我国研究者常常使用体外培养的鼻咽癌细胞系进行鼻咽癌相关病理机制及抗癌药物疗效研究。有文献报道CNE-1和CNE-2细胞系被HeLa细胞系杂交污染[3]。为了验证本课题组保存的两株鼻咽癌细胞系的身份，本研究使用STR鉴定技术进行了检测，实验结果证实这两株细胞系并非先前报道的HeLa杂交污染物，而是完全的HeLa替代物。细胞系交叉污染是全球面临的一个长期且严峻问题，研究者和细胞库做好细胞系的质量控制和交叉污染检查外，期刊杂志和资助机构等对细胞系交叉污染问题的学术规范也非常重要，只有施行全面的细胞系交叉污染防范和质量管理措施，才能够高效地推进全球根本解决细胞系质量问题。Reference1.SourenNY,FusenigNE,HeckS,DirksWG,Capes-DavisA,BianchiniF,PlassC:Celllineauthentication:anecessityforreproduciblebiomedicalresearch.Emboj2022,41(14):e111307.2.RojasA,GonzalezI:Celllinecross-contamination:adetrimentalissueincurrentbiomedicalresearch.CellBiolInt2018,42(3):272.3.ChanSY,Cho