血红蛋白的提取与分离

血红蛋白的提取与分离.第1页，共62页，2023年，2月20日，星期日(一）蛋白质占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物2、组成元素C、H、O、N一、基础知识1、含量3、相对分子质量高分子化合物第2页，共62页，2023年，2月20日，星期日4、基本组成单位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸连接方式脱水缩合第3页，共62页，2023年，2月20日，星期日8、分子结构7、肽键CONH氨基酸肽链蛋白质脱水缩合盘曲折叠（一条或者多条）第4页，共62页，2023年，2月20日，星期日10、生理功能细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别9、蛋白质结构的多样性第5页，共62页，2023年，2月20日，星期日①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个②若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成n-m个肽键,脱去个n-m个水分子，至有氨基和羧基各m个11、相关计算第6页，共62页，2023年，2月20日，星期日③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构④关于蛋白质相对分子量的计算：n个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么由此形成的蛋白质的相对分子量为n·a-(n-m)·18第7页，共62页，2023年，2月20日，星期日1、分离生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子2、蛋白质分离和提取的原理根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质(二）蛋白质的提取第8页，共62页，2023年，2月20日，星期日3、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构4、人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白第9页，共62页，2023年，2月20日，星期日（三）凝胶色谱法②实例：葡聚糖、琼脂糖3、凝胶1、别名：分配色谱法①性质：一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的通道2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离第10页，共62页，2023年，2月20日，星期日①大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道4、凝胶色谱法的原理—分子筛效应③分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离②当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢第11页，共62页，2023年，2月20日，星期日5、具体过程蛋白质分子量的大小4、依据的特性第12页，共62页，2023年，2月20日，星期日第13页，共62页，2023年，2月20日，星期日（四）缓冲溶液1、概念在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变2、作用第14页，共62页，2023年，2月20日，星期日4、缓冲溶液的组分分类①弱酸和弱酸盐组合H2CO3NaHCO3

CH3COOHCH3COONa3、缓冲溶液的配制通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液第15页，共62页，2023年，2月20日，星期日②弱碱和弱碱盐NH4OHNH4CL③多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐NaH2PO4Na2HPO4KH2PO4K2HPO4第16页，共62页，2023年，2月20日，星期日思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)第17页，共62页，2023年，2月20日，星期日（五）电泳：1、概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2、原理②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电第18页，共62页，2023年，2月20日，星期日③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离第19页，共62页，2023年，2月20日，星期日3、类型琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳4、实例由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量①应用②聚丙稀酰胺凝胶第20页，共62页，2023年，2月20日，星期日第21页，共62页，2023年，2月20日，星期日第22页，共62页，2023年，2月20日，星期日蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素③原理④SDS作用为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS第23页，共62页，2023年，2月20日，星期日SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小⑤SDS作用机理第24页，共62页，2023年，2月20日，星期日讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售.第25页，共62页，2023年，2月20日，星期日二、实验操作样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定1、样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤(1)血液组成（二）操作过程第26页，共62页，2023年，2月20日，星期日血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个a－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团①成分第27页，共62页，2023年，2月20日，星期日每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色②组成及作用本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白③选材第28页，共62页，2023年，2月20日，星期日第29页，共62页，2023年，2月20日，星期日(2)红细胞的洗涤①洗涤红细胞目的除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少②洗涤操作A、采集血样B、低速短时间离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果）第30页，共62页，2023年，2月20日，星期日C、吸取血浆：上层透明的黄色血浆D、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤E、低速离心（低速短时间）F、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净第31页，共62页，2023年，2月20日，星期日(3)血红蛋白的释放加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白(4)分离血红蛋白溶液①过程将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min第32页，共62页，2023年，2月20日，星期日第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）②试管中溶液层次第33页，共62页，2023年，2月20日，星期日用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体③分离第34页，共62页，2023年，2月20日，星期日取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时(5)透析除去样品中分子量较小的杂质①过程②透析目的第35页，共62页，2023年，2月20日，星期日第36页，共62页，2023年，2月20日，星期日2、凝胶色谱（1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端第37页，共62页，2023年，2月20日，星期日底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底注意事项：⑤安装其他附属结构③顶塞的制作打孔安装玻璃管④组装将上述三者按相应位置组装成一个整体第38页，共62页，2023年，2月20日，星期日第39页，共62页，2023年，2月20日，星期日（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择A、材料“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克B、代表意义：交联葡聚糖凝胶（G-75）第40页，共62页，2023年，2月20日，星期日配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液②凝胶的前处理③凝胶色谱柱的装填方法A、固定B、装填将色谱柱处置固定在支架上将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀第41页，共62页，2023年，2月20日，星期日注意：2、装填凝胶柱时不得气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙第42页，共62页，2023年，2月20日，星期日第43页，共62页，2023年，2月20日，星期日1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果注意：2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时④洗涤平衡第44页，共62页，2023年，2月20日，星期日（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面②滴加透析样品吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐关闭出口第45页，共62页，2023年，2月20日，星期日第46页，共62页，2023年，2月20日，星期日③样品渗入凝胶床④洗脱加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口小心加入pH为7的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）第47页，共62页，2023年，2月20日，星期日讨论：答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能⑥注意：正确的加样操作1、不要触及破坏凝胶面2、贴壁加样3、使吸管管口沿管壁环绕移动1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？第48页，共62页，2023年，2月20日，星期日2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。第49页，共62页，2023年，2月20日，星期日血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？第50页，共62页，2023年，2月20日，星期日（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳2、试剂的配制①丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺:用去离子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液②十二烷基硫酸钠（SDS）:用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存鉴定血红蛋白纯度1、目的第51页，共62页，2023年，2月20日，星期日③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液④TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合⑤用去离子水配制10%过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液⑥Tris—甘氨酸电泳缓冲液

25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1%的SDS第52页，共62页，2023年，2月20日，星期日⑦样品处理液

50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油⑨脱色液

10%的甲醇和10%的冰醋酸⑧染色液

0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸第53页，共62页，2023年，2月20日，星期日1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行注意事项：2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套第54页，共62页，2023年，2月20日，星期日①SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板（2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备用去离子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris缓冲液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的过硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高2—3mm），以阻止氧气进入凝胶溶液3、电泳方法步骤第55页，共62页，2023年，2月20日，星期日用去离子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的Tris缓冲液0.5mL，10%的SDS0.041mL，10%的过硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合②分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水（3）样品处理③配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液第56页，共62页，2023年，2月20日，星期日（5）加样在电泳样品中按1∶1体积比加入样品处理液，在100℃温度下加热3min，以使蛋白质变性按顺序加样，加样量通常为10—25μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品（4）浓缩胶聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。第57页，共62页，2023年，2月20日，星期日将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm处，关闭电源（6）