药品微生物检验特点及过程控制

药品微生物检验特点及过程控制1第1页，共48页，2023年，2月20日，星期日药品微生物检验特点及过程控制药品因素环境影响培养观察抽样检查破坏试验方法验证过程控制2中国药品生物制品检定所第2页，共48页，2023年，2月20日，星期日无菌/微生物限度检查理念环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断3中国药品生物制品检定所第3页，共48页，2023年，2月20日，星期日微生物检查的过程控制一、实验设施（硬件——物质保障）二、检验程序（软件——有效的结果）三、结果判断（调查——可靠的结论）4中国药品生物制品检定所第4页，共48页，2023年，2月20日，星期日一、实验设施实验室系统操作环境关键设备对照培养基物质保障5中国药品生物制品检定所第5页，共48页，2023年，2月20日，星期日（一）、实验室系统洁净实验条件有效性：整体10000级、局部100级。安全性：保护样品、人员和环境。可操作性：方便、快捷、顺畅。洁净实验条件的维护、验证阳性菌实验室达到P2生物安全标准6中国药品生物制品检定所第6页，共48页，2023年，2月20日，星期日实验室改造示例：原布局图

拟定布局图

建议布局图1

建议布局图2

实验室系统——中检所微生物实验室7中国药品生物制品检定所第7页，共48页，2023年，2月20日，星期日（一）、实验室系统实验室系统的管理与维护：1、屏障系统的有效性压差、风速、微粒、照度（外包服务合同）2、清洁、静态与动态监控、熏蒸3、环境菌库酒精棉球分离微生物新洁尔灭分离微生物8中国药品生物制品检定所第8页，共48页，2023年，2月20日，星期日环境菌库洁净环境常见菌（浮游菌）：头状葡萄球菌（Staphylococcus

capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）缓症链球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcus

cohnii）藤黄微球菌（Micrococcus

luteus）9中国药品生物制品检定所第9页，共48页，2023年，2月20日，星期日（二）、操作环境1、隔离器2、生物安全柜3、超净工作台10中国药品生物制品检定所第10页，共48页，2023年，2月20日，星期日（二）、操作环境分类样品安全人员安全环境要求点评隔离器？验证困难，灭菌不彻底：假阳性灭菌剂残留：假阴性生物安全柜？动态验证困难，不适合多任务的检验活动超净工作台经典、廉价、适合多任务的检验活动。提高实验室新风供给、加强实验室监控可以扬长避短11中国药品生物制品检定所第11页，共48页，2023年，2月20日，星期日搽拭实验菌株菌液计数回收计数回收率大肠埃希菌191894.7%金黄色葡萄球菌646093.8%菌液稀释、分液的误差为：5.5%表面搽拭操作的回收率大于99%12中国药品生物制品检定所第12页，共48页，2023年，2月20日，星期日（三）、关键设备微生物检查薄膜过滤仪一次性薄膜过滤培养器应急检验用一次性薄膜过滤培养器13中国药品生物制品检定所第13页，共48页，2023年，2月20日，星期日（四）、对照培养基培养基适用性（灵敏度）；培养基性能稳定性（标准化）。对照培养基理化评价（可控性）生物学评价（有效性）回收率比较MPN比较生长曲线比较生态评价某些CRS原则固态培养基液态培养基琼脂加减法14中国药品生物制品检定所第14页，共48页，2023年，2月20日，星期日二、检验程序环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断15中国药品生物制品检定所第15页，共48页，2023年，2月20日，星期日二、检验程序接受任务实验方案实验准备样品核对实验操作过程监控培养观察有效的结果物质保障16中国药品生物制品检定所第16页，共48页，2023年，2月20日，星期日实验室管理规范（软件）中检所抗生素室微生物实验室质量管理体系编写说明及批准页1实验室概况1.1实验室简介1.2实验室通讯资料1.3实验室认可项目/参数表1.4实验室平面图及功能区域1.5仪器设备总览1.6常备试剂耗材一览表1.7实验室发展目标2管理规范2.1安全管理2.2业务流程2.3人员管理（6个SOP）2.4样品管理（3个SOP）3标准操作规程3.1检验工作SOP（13个）3.2仪器操作SOP（30个）3.3实验记录SOP（9个）4实验室保障4.1实验室设施、设备及消耗品供应商确定原则4.2实验室设施服务商4.3实验设备供应商4.4实验室消耗品供应商17中国药品生物制品检定所第17页，共48页，2023年，2月20日，星期日（一）、实验准备实验准备应坚持“平战结合”，物质准备有备无患，应随时保证“来之能战”。尤其注意常备有效期要求的物品：培养基、冲洗液、滤器、小型实验器材等。18中国药品生物制品检定所第18页，共48页，2023年，2月20日，星期日实验准备——无菌室专用酒精棉球制备

实验准备——场地清洁

实验准备——台面清洁

19中国药品生物制品检定所第19页，共48页，2023年，2月20日，星期日（二）、样品核对尽快取得样品，确保样品传递过程中的完整性、安全性、有效性；仔细核对样品及样品资料，高度关注媒体公布样品（问题样品），同时尽量获取非问题样品及同类样品，进行比较实验、比较分析；样品外观检查、完整性检查。20中国药品生物制品检定所第20页，共48页，2023年，2月20日，星期日样品外观检查——欣弗

样品外观检查——刺五加

样品外观检查——双黄连

样品完整性真空检漏

21中国药品生物制品检定所第21页，共48页，2023年，2月20日，星期日（三）、实验操作不断完善标准化操作规程（SOP），严格避免实验室污染。实验人员培养基实验器材实验环境检验结果待检样品原料辅料设备环境药品（食品）人员药品食品生产过程中可能污染微生物的主要环节药品食品微生物检查过程中可能污染微生物的主要环节22中国药品生物制品检定所第22页，共48页，2023年，2月20日，星期日实验操作——物料进场消毒液搽拭物品外表面洁净传递（风淋、紫外照射）双层无菌包装核心区外围实验操作——人员进场一更二更核心操作区实验操作——无菌操作技术23中国药品生物制品检定所第23页，共48页，2023年，2月20日，星期日（四）、实验过程监控样品监控手指监控沉降菌监控无菌检验框架示意图24中国药品生物制品检定所第24页，共48页，2023年，2月20日，星期日三、结果判断长菌与否分离鉴定溯源调查结果报告可靠的结论有效的结果物质保障25中国药品生物制品检定所第25页，共48页，2023年，2月20日，星期日三、结果判断

是不是微生物？是什么微生物？微生物来自哪里？几点思考

参见：《FTIR法用于药品检出菌与药品微生物检验洁净室环境菌的相似性考察》《药学学报》，2007，42（11）：1189～1194《判断无菌检查阳性结果有效性的实验探讨》《药物分析杂志》，

2008，28（05）：66～71

26中国药品生物制品检定所第26页，共48页，2023年，2月20日，星期日1、长菌与否？浑不浑浊?物理变化、化学变化还是生物变化？一靠经验二靠实验三靠严格程序控制避免干扰27中国药品生物制品检定所第27页，共48页，2023年，2月20日，星期日是不是微生物？（1）、液体培养基浑浊物理变化？化学变化？生物学变化？（2）、平板上的菌落琼脂表面、琼脂中、琼脂和平皿夹层

菌落or药渣？28中国药品生物制品检定所第28页，共48页，2023年，2月20日，星期日菌落or药渣？经60Coγ射线大剂量照射再检验延长培养时间到7天重新划线培养镜检29中国药品生物制品检定所第29页，共48页，2023年，2月20日，星期日2、分离鉴定（1）立即转接2ml该培养物至相同的培养基中继续培养；（2）取5支冻存管，每管分装1ml浑浊培养物，-80℃保存；（3）取浑浊培养物在TSA平板/血琼脂上划线，分离污染微生物；（4）如果发现硫乙醇酸盐流体培养管变浑浊，还应增加血平板划线，并在厌氧条件下培养分离厌氧菌。由平板分离到的菌落应进一步鉴定，并逐一保藏。30中国药品生物制品检定所第30页，共48页，2023年，2月20日，星期日是什么微生物？宏观：生长形态微观：镜检鉴定：生化鉴定（API、BD）核酸鉴定（16sRNA、DNA）

……31中国药品生物制品检定所第31页，共48页，2023年，2月20日，星期日3、溯源调查样品阳性培养物分离菌株检验过程监控菌株环境菌（近期、远期）现场调查收集菌株鉴定与相似性分析相结合传统方法与新技术相结合不同方法的交叉验证32中国药品生物制品检定所第32页，共48页，2023年，2月20日，星期日微生物来自哪里？

相似性分析同源性分析脉冲场电泳（PFGE）、傅立叶红外（FTIR）

33中国药品生物制品检定所第33页，共48页，2023年，2月20日，星期日SamplePreparationAutomatedmeasurementafterdryingofthesamples!2.Suspending1.Harvesting3.LoadingFT-IRSpektrumofmicroorganisms图不同来源的阴沟肠杆菌红外图谱聚类关系34中国药品生物制品检定所第34页，共48页，2023年，2月20日，星期日TheInfraredSpectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercellwallcapsulesDNA,RNAflagellates,piliribosomevacuoles...FT-IRspectrumisafingerprintofthecellsBiochemicalStructureofCells35中国药品生物制品检定所第35页，共48页，2023年，2月20日，星期日36中国药品生物制品检定所第36页，共48页，2023年，2月20日，星期日溯源性分析例1——欣弗事件

图29欣弗培养物图30欣弗培养物分离菌株镜检37中国药品生物制品检定所第37页，共48页，2023年，2月20日，星期日编号滤筒中形态革兰染色BD鉴定0206L浑浊，产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘质沙雷菌（Serratiamarcescens）0206G浑浊，剧烈产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘质沙雷菌（Serratiamarcescens）0112G致密片状、絮状物，振摇不散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）0104L颗粒状悬浮物，振摇能散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）298L；298G浑浊，产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘质沙雷菌（Serratiamarcescens）303L；303G浑浊，产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、阴沟肠杆菌（Enterobacter

cloacae）305L；305G浑浊，产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘质沙雷菌（Serratiamarcescens）306L；306G浑浊，产气G-球杆菌肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）307G浑浊，产气G-球杆菌肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）308L浑浊（Alcaligenesfaecalis）308G致密片状、絮状物，振摇不散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）309L浑浊（Alcaligenesfaecalis）309G致密片状、絮状物，振摇不散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）304G浑浊G-杆菌嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）38中国药品生物制品检定所第38页，共48页，2023年，2月20日，星期日溯源性分析例1——欣弗事件头状葡萄球菌头状亚种（Staphylococcus

capitissspcapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）缓症链球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌科氏亚种（Staphylococcus

cohniissp

cohnii）藤黄微球菌（Micrococcus

luteus）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）。监测到的环境菌株39中国药品生物制品检定所第39页，共48页，2023年，2月20日，星期日溯源性分析例2编号BD鉴定走廊1B.pumilus走廊2M.luteus走廊3/无菌室4C.urealyticum无菌室5K.kristinae无菌室6C.urealyticumC1524-FS.capraeC1524-BS.capraeC1525-B1-1S.warneriC1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.warneriC1526-F1S.epidermidisC1526-F2S.haemolyticus菌株16sRNA鉴定可信度C1524-FS.haemolyticus99%C1524-BS.haemolyticus98%C1526-F2S.haemolyticus100%双黄连注射液利巴韦林注射液FTIR相似性分析DuPontRiboPrinter基因指纹分析40中国药品生物制品检定所第40页，共48页，2023年，2月20日，星期日几点思考（1）、怎样才算是同一株菌？

需要深入认识微生物本身微生物变异与保守的相对性；分析方法的可变性与微生物本身的可变性；生物学先锋琳恩·马古利斯(LynnMargulis)曾表示：“如果将一个特殊的质粒植入大肠杆菌，大肠杆菌便会突然间变成克雷伯氏杆菌”。41中国药品生物制品检定所第41页，共48页，2023年，2月20日，星期日几点思考（2）、什么是最适宜的技术？

需要深入认识分析微生物的技术和手段形态学分析与相似性分析（生化反应谱、片段相似性、FTIR光谱相似性等），在权衡方法本身的边界和微