生物分离工程细胞破碎专家讲座

学习目标和要求掌握解细胞分离和目标产物释放原理和方法，熟知各种方法优缺点和应用范围。

生物分离工程细胞破碎专家讲座第1页目录一、细胞分离（一）、重力沉降（二）、离心沉降（三）、过滤二、细胞破碎与胞内物释放生物分离工程细胞破碎专家讲座第2页细胞分离－学习关键点识记：重力沉降、离心沉降和过滤概念。了解：重力沉降、离心分离与过滤原理、理论；掌握Stokes（斯托克斯）沉降公式

。应用：惯用离心方法及优缺点；利用掌握提升分离效率方法分析决实际问题

生物分离工程细胞破碎专家讲座第3页（一）、重力沉淀1、重力沉淀定义2、重力沉淀理论3、提升重力沉降路径生物分离工程细胞破碎专家讲座第4页1、重力沉降定义

重力沉降是传统化工过程中惯用从含有固体颗粒流体中将颗粒分离出来操作。

重力沉降是利用流体与颗粒间密度差，在重力作用下使颗粒与流体之间产生相对运动，从而实现二者分离。

在生物分离过程中，定义中颗粒为细胞、细胞碎片等有形物生物分离工程细胞破碎专家讲座第5页千姿百态微生物世界BacterialmorphologydiagramHigh-densitycellculture生物分离工程细胞破碎专家讲座第6页2、重力沉降理论理论假设细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理；颗粒在无限稀释溶液中进行沉降，颗粒之间无相互干扰

受力分析

球形颗粒重力fg液体浮力fb颗粒运动方向相反阻力

fs生物分离工程细胞破碎专家讲座第7页FbFg

Fsd=2R球形颗粒沉降受力情况生物分离工程细胞破碎专家讲座第8页重力沉降理论重力：浮力：阻力：d,Ps—分别指颗粒直径（m）和密度（kg.m-3）生物分离工程细胞破碎专家讲座第9页生物分离工程细胞破碎专家讲座第10页重力沉降理论当球形颗粒本身重力与其所受到浮力和阻力到达平衡时，

则生物分离工程细胞破碎专家讲座第11页重力沉降理论当球形颗粒处于滞流区（）时

Stokes公式当球形颗粒处于过渡区（）时

Allen公式当球形颗粒处于湍流区（）时Newton公式生物分离工程细胞破碎专家讲座第12页千姿百态微生物世界BacterialmorphologydiagramHigh-densitycellculture球形颗粒？无限稀释溶液？生物分离工程细胞破碎专家讲座第13页3、提升重力沉降路径加入中性盐：双电层排斥电位降低加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝图引入外力生物分离工程细胞破碎专家讲座第14页（二）、离心沉淀1、离心沉淀定义2、离心沉淀理论3、离心分离方法4、离心分离设备生物分离工程细胞破碎专家讲座第15页1、离心沉降定义离心沉降是利用沉降设备使流体和颗粒旋转，在离心力作用下，因为颗粒和流体间存在密度差，所以颗粒沿径向与流体产生相对运动，从而使颗粒和流体分离。生物分离工程细胞破碎专家讲座第16页生物分离工程细胞破碎专家讲座第17页生物分离工程细胞破碎专家讲座第18页2、离心沉降理论离心沉降速度

令：生物分离工程细胞破碎专家讲座第19页3、离心分离方法差速离心分级区带离心差速区带离心平衡区带离心生物分离工程细胞破碎专家讲座第20页差速离心分离差速离心是以菌体细胞搜集或除去为目标固液离心分离方法，应用某一特定颗粒沉淀离心力在预定离心时间内得到一部分颗粒沉淀及包含未沉淀颗粒上清液。生物分离工程细胞破碎专家讲座第21页差速离心分离应用实例600g10min15000g10min100000g60min300000g120minnucleiMitochondrialysosomesPlasmamembraneRiosomalsubunitshomogenateFilteredhomogenateSolublepartofcytoplasmSedimentation生物分离工程细胞破碎专家讲座第22页区带离心分离－前提

在离心管内溶液存在密度梯度。采取事先配好不一样浓度（密度）梯度介质（蔗糖等），按照浓度从大到小标准，依次层层加入。加入离心管中梯度介质经高速离心或静置后可形成连续密度梯度。生物分离工程细胞破碎专家讲座第23页操作过程生物分离工程细胞破碎专家讲座第24页区带离心种类差速区带离心(速度区带离心）平衡区带离心（等密度离心）生物分离工程细胞破碎专家讲座第25页差

速

区

带

离

心生物分离工程细胞破碎专家讲座第26页差速区带离心基于颗粒大小、形状分离梯度液最大密度不能超出所分离颗粒最大密度离心过程中，颗粒不停沉降至其浮力密度与梯度液密度相等动态离心分离方法生物分离工程细胞破碎专家讲座第27页平衡区带离心生物分离工程细胞破碎专家讲座第28页平衡区带离心梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度离心过程中，颗粒不停沉降至其浮力密度与梯度液密度相等平衡离心分离方法生物分离工程细胞破碎专家讲座第29页梯度液种类和应用生物分离工程细胞破碎专家讲座第30页细胞分离－区带离心异同区带离心种类差速区带离心平衡区带离心共同点事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度梯度介质惯用蔗糖惯用氯化铯密度梯度最大密度梯度低于最大密度沉降样品最大密度梯度大于最大密度沉降样品区带形成条件依据各个组分沉降系数差异，形成各自区带依据各组分密度差形成区带离心条件在最前沉降物质到达管底前停顿，短时间，低速度使各组分沉降到其平衡密度区，长时间，高速度

生物分离工程细胞破碎专家讲座第31页离心方法新进展详细表现在哪几个方面？1.固定角转子垂直管离心法进展使用垂直管转子成功之例是1980年由B.H.Chung等提升血清脂蛋r白分离SVs方法(即SingleVerticalSpin法,一单次垂直管离心法)，它使对临床诊疗意义很大这一分离在实用上成为可能.传统血清脂蛋白分离用“次序浮选法”(即SF法)，一次分离需时3天，用去驱动寿命1亿转以上。现用垂直管转子作SVS方法，不连续NaCI/KBr或NaCI/Sucrose梯度，5.5万一6.5万转/分，0.75-2.5i)时，一次分离成功。生物分离工程细胞破碎专家讲座第32页3.短液柱离心法(Short-Columnmethod)由美国0.M.Griffith在1978年提出。短柱法是在角式或水平转子中人为地使用不加满离心管来降低液柱高。此法不但降低液柱高以降低离心时间，更主要是使处千液面样品受到更大离心力从而深入缩短了离心时间，在不降低样品量和样品浓度条件下，可把离心时间缩短为常规满管离心时二分之一或更少。短液柱法使用中厚PC管和厚壁PA管，它们在不加满离心时也不会变形。生物分离工程细胞破碎专家讲座第33页4.细绝(或细菌)离心洗脱(Flutriator)技术这是美国Beckman企业近年发展一个低速连续洗脱技术，尤其适合用于培养液连续搜集。使用是带小容量连续离心池JE-6B转子.其洗脱原理不是在普通转子中沉降，而是被分离物在离心中“浮选”。用4.2ml离心池可在1小时内从100-1000m!原液中回收10'-10，个细胞。生物分离工程细胞破碎专家讲座第34页2.超速连续离心法超速连续离心转子是由美国Beckman企业开发，最适合用于病毒纯化，从大量组织匀浆中分离亚细胞组织、培养液中细菌搜集，以及污水研究。生物分离工程细胞破碎专家讲座第35页4、离心设备分类分类方法名称处理量试验室用离心机，工业用离心机温度常温离心机、冷冻离心机转速低速离心机、高速离心机、超速离心机转子结构管式、碟式生物分离工程细胞破碎专家讲座第36页惯用离心设备Solids-ejectingdiskbowlcentrifugeofpilotsizeforsterilizablecontainedinstallation

Nozzlemachinewithpressurizedsolidsdischargeforyeastandbacteriaseparation

生物分离工程细胞破碎专家讲座第37页惯用离心设备Decantercentrifuge

Multichamberbowl,verticalcut

生物分离工程细胞破碎专家讲座第38页管式离心设备AdisposablecellseparationinsertPowerfugeTMone-chamberwithscraper生物分离工程细胞破碎专家讲座第39页Tubularbowl生物分离工程细胞破碎专家讲座第40页碟片离心设备(a)Solids-retainingdiskbowl,(b)Radialsolids-ejectingdiskbowl,topfeed.(c)Radialsolids-ejectingdiskbowl,hermeticfeed.(d)Axialsolids-ejectingdiskbowl.(e)Nozzlebowlwithpressurizedsolidsdischarge.(f)Nozzlebowlwithperipheraldischargenozzles.生物分离工程细胞破碎专家讲座第41页生物分离工程细胞破碎专家讲座第42页离心设备比较管式离心机优点结构简单，转速和离心力较大缺点沉降面积小、处理能力低；碟式离心机优点转子中存在隔板以增大沉降面积，处理能力大缺点结构复杂、转速较低；生物分离工程细胞破碎专家讲座第43页离心机处理能力粒子在径向上沉降速度

轴向移动速度

完全沉降边界条件

生物分离工程细胞破碎专家讲座第44页离心机处理能力影响原因

处理样品特征，如密度、粒径等溶液特征，如密度、粘度等离心机机械结构，如r1和r2操作条件，ω

生物分离工程细胞破碎专家讲座第45页（三）、过滤1、过滤定义2、过滤受力分析3、提升过滤速度路径生物分离工程细胞破碎专家讲座第46页1、过滤定义过滤是利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中固体粒子，进行固液分离方法。

过滤本身是一个膜分离技术。在分离细胞、菌体或它们碎片过程中除了沉降分离方法外，过滤技术也是一个常备分离方法。生物分离工程细胞破碎专家讲座第47页2、过滤过程受力分析推进力：过滤操作以压力差为主要推进力；

阻力：过滤过程阻力来自多孔性过滤介质和介质表面不停堆积形成滤饼

生物分离工程细胞破碎专家讲座第48页过滤速率Q：液体流量A:面积Rm表示介质阻力；Rc表示滤饼阻力；μL为滤液粘度生物分离工程细胞破碎专家讲座第49页恒压过滤方程Ruth恒压过滤方程其中，K为Ruth恒压过滤系数，表示为生物分离工程细胞破碎专家讲座第50页3、提升过滤速度路径采取絮凝或凝聚方法预处理改变料液性质，降低滤饼阻力加入助滤剂以改变滤饼压缩性指数，提升过滤速度生物分离工程细胞破碎专家讲座第51页

滤饼传统过滤cakeConventionalfiltration生物分离工程细胞破碎专家讲座第52页生物分离工程细胞破碎专家讲座第53页生物分离工程细胞破碎专家讲座第54页生物分离工程细胞破碎专家讲座第55页生物分离工程细胞破碎专家讲座第56页二、细胞破碎与胞内物释放1、概述2、细胞破碎技术分类3、惯用破碎方法介绍生物分离工程细胞破碎专家讲座第57页－学习关键点了解：各种细胞破碎方法原理、优缺点及其适用范围。应用：采取不一样细胞破碎方法对不一样细胞进行不一样程度破碎。生物分离工程细胞破碎专家讲座第58页1、概述（1）细胞结构（2）细胞膜组成（3）影响产物释放原因生物分离工程细胞破碎专家讲座第59页（1）细胞结构

（真核细胞与原核细胞）动物细胞没有细胞壁，只有由脂质和蛋白质组成细胞膜植物细胞细胞膜外有一层坚固细胞壁酵母细胞细胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质组成，愈加难以破碎真核细胞原核细胞革兰氏阳性菌细胞壁由肽聚糖层组成，壁厚约15～50nm，肽聚糖含量为40~90%，细胞壁较革兰氏阴性菌坚固。革兰氏阴性菌细胞壁在肽聚糖外侧还有分别由（1）脂蛋白和（2）磷脂和脂多糖组成两层外壁层，外壁层厚度越8～10nm。生物分离工程细胞破碎专家讲座第60页（2）细胞膜组成（A）（B）生物分离工程细胞破碎专家讲座第61页（3）影响产物释放环境原因在复杂培养基中生长大肠杆菌细胞其破碎较单一培养基中生长大肠杆菌细胞更难；对数生长久细胞会表现得愈加脆弱。从连续培养过程中取得、含有较高比生长速率念珠菌细胞壁愈加脆弱，而摇瓶培养念珠菌体则有愈加充裕机会构建愈加坚固细胞壁。酵母细胞壁厚度和破碎阻力随年纪增加而增加经常在幼酵母细胞中出现芽痕（Budscars）可引发酵母细胞局部细胞壁强度降低生物分离工程细胞破碎专家讲座第62页2、细胞破碎技术分类细胞破碎目标是释放出细胞内含物，其方法很多，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。生物分离工程细胞破碎专家讲座第63页细胞破碎技术分类细胞破碎机械破碎高压均浆法，珠磨法、撞击破碎、超声波破碎非机械破碎物理法渗透压冲击、冻结-融化、（超声波）化学法酸碱处理、化学试剂处理生物法酶溶、自溶、噬菌体生物分离工程细胞破碎专家讲座第64页生物分离工程细胞破碎专家讲座第65页3、惯用细胞破碎方法介绍生物分离工程细胞破碎专家讲座第66页

（1）机械破碎－高压匀浆细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀杆之间环隙高速（可到达450m/s）喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。

生物分离工程细胞破碎专家讲座第67页缺点：这种方法较易造成堵塞团状或丝状真菌，较小革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适适用该法处理。生物分离工程细胞破碎专家讲座第68页（2）机械破碎－－珠磨珠磨机破碎室内填充有80～85％（v/v）玻璃（密度为2.5g/ml）或氧化锆（密度为6.0g/ml）微球（粒径约0.1~1.0mm）。在搅拌桨高速搅拌下微球高速运动，微球与微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。生物分离工程细胞破碎专家讲座第69页缺点：设备是珠后机，在珠波分离器帮助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生热量由夹套中冷却液带走。存在问题：操作参数多，普通凭经验预计而且珠子之间液体损失30％左右。生物分离工程细胞破碎专家讲座第70页（3）机械破碎－－撞击破碎撞击破碎原理：细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（冻结速度为数千℃/min），形成粒径小于50微米微粒子，高速载气（如氮气，流速为300m/s）将冻结微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结细胞发生破碎。生物分离工程细胞破碎专家讲座第71页

（4）机械破碎－－超声波破碎压电传感器将电子振荡器交变电流转换为声波。在超声波作用下液体发生空化作用，空穴形成、增大和闭合产生极大冲击波和剪切力，使细胞破碎。生物分离工程细胞破碎专家讲座第72页生物分离工程细胞破碎专家讲座第73页缺点：超声波破碎在试验室规模应用较普遍，处理少许样品时操作简便，液量损失少，不过超声波产生化学自由基团能使一些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热都有困难。生物分离工程细胞破碎专家讲座第74页－非机械破碎之酸碱处理化学试剂处理酶溶自溶渗透压冲击法冻结-融化法生物分离工程细胞破碎专家讲座第75页（5）化学渗透法有些有机溶剂(如苯、甲苯