医疗器械检化员微生物培训专家讲座

一、人员资质及培训要求

从事医疗器械微生物检验工作人员应具备微生物学或相近专业知识教育背景。检验人员应依据所在岗位和职责接收对应培训，在确认它们能够负担某一检验前，他们不能独立从事该项微生物检验。应确保全部些人员在上岗前接收胜任工作所必须设备操作、微生物检验技术和试验室生物安全等方面培训，经考评合格后方可上岗，同时，试验室应制订全部级别试验人员继续教育计划。检验人员必须熟悉相关监测方法、程序、检验目标和结果评价。微生物试验室管理者其专业技能和经验水平应与他们职责范围相符，如：管理技能、试验室安全、检验安排、预算、试验研究、试验结果评定和数据偏差调查、技术汇报书写等。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第1页

二、试验室环境控制【标准】试验室布局设计基本标准是既要最大可能预防微生物污染，又要预防检验过程对环境和人员造成危害。通常，试验室应划分成洁净或无菌区域和活菌操作区域，同时应依据试验目标，在时间或空间上有效分隔不相容试验活动，将交叉污染风险降低到最低。普通情况下，医疗器械微生物检验试验室应含有开展无菌检验、微生物程度检验等检测活动、独立设置洁净室（区）或隔离系统，并为上述检验配置对应细菌（真菌）等试验室、培养室、文档处理区等辅助区域，同时，应对上述区域明确标识。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第2页二、试验室环境控制【要求】1、无菌检验应在环境洁净度10000级下局部洁净度100级单向流空气区域内或隔离系统中进行。用于无菌检验和微生物程度检验洁净操作室应配有属于“人流净化”更衣室及属于“物流净化”缓冲间或传递窗（柜），使进入洁净操作室试验人员和试验物品分别经适当净化后进入试验操作间。无菌室分无菌操作室和缓冲间。无菌操作室应含有空气除菌过滤单向流空气装置。操作室或工作台应保持正压。应在压差十分主要相邻级别区之间安装压差表。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第3页二、试验室环境控制【要求】2、微生物程度检验全过程，均应恪守无菌操作，严防再污染。所以，微生物程度检验宜在环境洁净度10000级下局部洁净度100级单向流空气区域内进行；程度检验试验室应配有对应人流和物流缓冲间，并定时作环境监测。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第4页二、试验室环境控制

【要求】

3、菌种处理、微生物判别和阳性对照室菌种处理包含内容比较多，如菌种传代、保藏、制备以及培养基促生长试验、阳性对照、微生物方法验证、消毒剂和防腐剂效力测定和对环境中分离菌判别等，这些试验过程中都在处理活微生物，处理不妥会造成试验室环境污染，影响其它试验结果，所以，该室必须与其它试验室严格分开；必要时，应按试验室性质需要保持对相邻试验室相对压差；需采取必要消毒方式确保试验室洁净条件合格（如臭氧，乳酸熏蒸等），以净化层流台作为局部100级控制办法，最好是使用生物安全柜，全部与活毒菌种相关活动都应在层流台或生物安全柜中进行。每次试验结束后要对层流台或生物安全柜及整个试验室环境进行消毒。全部与菌种相关试验废物均应经过灭菌处理后方可丢弃。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第5页二、试验室环境控制【要求】4、培养室及其它功效间培养室用于放置培养细菌和真菌培养箱。准备区即试液及培养基配制/灭菌区域、试验器皿洗涤、烘干、灭菌、试验用具及易耗品储备等没有特殊要求功效间，可为普通清洁环境。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第6页微生物环境控制相关标准GB/T16292:，医药工业洁净室(区)悬浮粒子测试方法GB/T16293:，医药工业洁净室(区)浮游菌测试方法GB/T16294:，医药工业洁净室(区)沉降菌测试方法GB50073-洁净厂房设计规范ISO14644-1:1999洁净室及相关受控环境第1部分：空气洁净度等级划分ISO14644-4:1999洁净室及相关受控环境第4部分：设计、施工、运行ISO14644-7:1999洁净室及相关受控环境第7部分：分离设备医疗器械检化员微生物培训专家讲座第7页无菌室环境控制设备微粒计数仪医疗器械检化员微生物培训专家讲座第8页无菌室环境控制设备浮游菌采样仪医疗器械检化员微生物培训专家讲座第9页无菌室环境控制设备医疗器械检化员微生物培训专家讲座第10页洁净室沉降菌测试方法1.测试时间1.1对单向流，如100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始。1.2对非单向流，如10000级、100000级以上净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。2.采样方法将已制备好培养皿按要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。2.2.培养全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。在30℃～35℃培养箱中培养，时间不少于48h。每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第11页洁净室沉降菌测试方法3.菌落计数用肉眼直接计数，标识或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检验，有否遗漏。若培养皿上有2个或2个以上菌落重合，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。4.注意事项4.1测试用具要作灭菌处理，以确保测试可靠性、正确性。4.2采取一切办法预防人为对样本污染。4.3对培养基、培养条件及其它参数作详细统计。4.4因为细菌种类繁多，差异甚大，计数时普通用透射光于培养皿后面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物区分，必要时用显微镜判别。4.5采样前应仔细检验每个培养皿质量，如发觉变质、破损或污染应剔除。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第12页洁净室沉降菌测试方法5.测试规则5.1.测试状态5.1.1沉降菌测试前，被测试洁净室（区）温湿度须到达要求要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在要求值内。5.1.2沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。5.1.3测试状态有静态和动态两种，测试状态选择必须符合生产要求，并在汇报中注明测试状态。5.2.测试人员5.2.1测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别工作服。5.2.2静态测试时，室内测试人员不得多于二人。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第13页最少采样点数目面积洁净度级别10010000100000<102～322≥10～＜20422≥20～＜40822≥40～＜1001642≥100～＜20040103≥200～＜40080206≥400～＜10001604013≥1000～＜4001003280020063注：表中面积，对于单向流洁净室.指是送风面积；对非单向流洁净室，指是房间面积医疗器械检化员微生物培训专家讲座第14页同时满足最少平皿数洁净度级别所需Φ90mm培养皿数（以沉降0.5h计）100级1410000级2100OOO级2医疗器械检化员微生物培训专家讲座第15页采样点布置采样点位置能够同悬浮粒子测试点。a）工作区采样点位置离地0.8m～1.5m左右（略高于工作面）。b）可在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。采样点位置详细规则见附录B（标准附录）。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第16页采样点布置医疗器械检化员微生物培训专家讲座第17页洁净度级别沉降菌浮游菌尘粒最大允许数/m3个/（Φ90mm）0.5h）活微生物数/m3≥0.5µm≥5µm100≤1≤5≤3500－10000≤3≤100≤350000≤环境检测参照标准医疗器械检化员微生物培训专家讲座第18页微生物试验室管理严格区分污染区及清洁区医疗器械检化员微生物培训专家讲座第19页相关标准GB15979-一次性使用卫生用具卫生标准GB15980-1995一次性使用医疗用具卫生标准GB15981-1995消毒与灭菌效果评价方法和标准医疗器械检化员微生物培训专家讲座第20页三、灭菌控制

微生物试验使用试剂、器材等常需用湿热灭菌法。湿热灭菌温度和时间需验证，必须确保物品灭菌后无菌确保值SAL≤10-6。灭菌程序经验证合格后方可使用。定时进行BD试验、真空泄漏测试、温度参数测试（空载热分布、定载热穿透、满载热穿透）、压力改变速率测试（GB8599-大型蒸汽灭菌器技术要求），同时以生物指示剂验证灭菌效果,必须确保物品灭菌后无菌确保值SAL小于百万分之一。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第21页三、灭菌控制

全部器具应采取可靠方法灭菌置压力蒸汽灭菌器内121℃30min或置电热干燥箱内180℃2h。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第22页湿热灭菌控制相关标准GB18281.3-医疗保健产品灭菌生物指示物第3部分:湿热灭菌用生物指示物ISO11138-3-医疗保健产品灭菌.生物指示物.第3部分:湿热灭菌用生物指示剂医疗器械检化员微生物培训专家讲座第23页四、培养基管理1、培养基制备2、培养基贮藏3、培养基质量控制试验医疗器械检化员微生物培训专家讲座第24页四、培养基管理灵敏度检验（中国药典）无菌检验（ISO11737.2:或GBT19973.2-）医疗器械检化员微生物培训专家讲座第25页五、无菌操作定义：是指在执行试验过程中，预防一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染操作技术和管理方法。无菌操作技术是微生物试验基本技术，是确保微生物试验准确和顺利完成主要步骤。无菌操作技术主要包含两方面：创造无菌培养环境及在操作和培养过程中预防一切其它微生物侵入。创造无菌培养环境包含提供密闭培养容器、培养容器灭菌、培养基灭菌等；预防一切其它微生物侵入办法包含紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第26页微生物试验前准备微生物试验控制1：人员管理微生物试验控制2：环境控制微生物试验控制3：灭菌控制微生物试验控制4：培养基管理微生物试验控制5：无菌操作医疗器械检化员微生物培训专家讲座第27页微生物基本操作

琼脂平板接种法琼脂斜面接种法半固体接种法肉汤培养基接种法医疗器械检化员微生物培训专家讲座第28页琼脂平板接种法细菌在自然界及人体中分布广，种类多，为了了解菌谱，须先将各种细菌分离，取得纯菌培养物后才能深入作细菌判定。琼脂平板培养基因面积大，接种后可到达分离目标，常称分离培养法。平板接种方法有各种。以下介绍平行划线法及分区划线法。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第29页琼脂平板接种法（分离培养法）分区划线法医疗器械检化员微生物培训专家讲座第30页琼脂平板接种法（分离培养法）平行划线法医疗器械检化员微生物培训专家讲座第31页琼脂平板接种法（分离培养法）医疗器械检化员微生物培训专家讲座第32页单个菌落医疗器械检化员微生物培训专家讲座第33页单个菌落医疗器械检化员微生物培训专家讲座第34页琼脂斜面接种法目标：多用于纯种细菌增菌和保留菌种方法：用灭菌接种环取细菌培养物少许。拔去琼脂斜面培养基塞，管口经火焰上灭菌，将沾有细菌接种环伸入管内，自下而上在琼脂上蜿蜒划线；接种后，管口在火焰上灭菌，塞回塞，接种环灭菌：在试管口处做好标识，置37℃培养18－24小时医疗器械检化员微生物培训专家讲座第35页大肠杆菌斜面金黄色葡萄球菌斜面医疗器械检化员微生物培训专家讲座第36页肉汤接种法目标：用于增菌。方法：用灭菌接种环取细菌培养物少许；以无菌操作将沾有细菌接种环伸入肉汤中，将环上细菌轻轻研磨于靠近液面管壁上，然后将试管稍倾斜，使肉汤碰及细菌即可；接种后管口灭菌，塞回塞，接种环灭菌，并做好标识，置37℃培养18-24小时医疗器械检化员微生物培训专家讲座第37页半固体接种法（穿刺接种法）目标：增菌和保留菌种；观察细菌有没有动力。方法：用接种针，将取有细菌接种针自培养基中央刺入（不要接触管底），沿原穿刺线拨出，注意在刺入与拔出时不可晃动接种针；接种后做好标识。置37℃培养18-24小时．医疗器械检化员微生物培训专家讲座第38页半固体琼脂培养基（0.5%）

医疗器械检化员微生物培训专家讲座第39页菌悬液制备（使用麦氏比浊管）麦氏比浊管：是McFarland创造一个用于微生物比浊不一样浊度标准浊度管。详细配制方法是依据硫酸和氯化钡百分比来定，有表可查，这么不一样百分比生成硫酸钡沉淀浓度不一样，且都有定值。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第40页麦氏比浊管配比管号(McFarland)0.5123450.25%BaCl2（ml）0.20.40.81.21.62.01%H2SO4(ml)9.89.69.28.88.48.0细菌近似浓度(×108/ml)13691215医疗器械检化员微生物培训专家讲座第41页菌悬液制备（使用麦氏比浊管）【材料】1、试验所需微生物新鲜培养物如：金黄色葡萄球菌新鲜培养物；2、无菌生理盐水、麦氏比浊管；3、酒精灯、接种环、无菌吸管、平皿。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第42页菌悬液制备（使用麦氏比浊管）【方法】1、轻摇标准试管；2、无菌操作挑取金黄色葡萄球菌新鲜培养物至无菌生理盐水试管（与标准管相同直径）中混匀，直到浊度与所要求标准管浓度相同；3、序列稀释已挑取菌落生理盐水试管至所需菌液浓度如：100cfu/ml;4、用平皿计数法验证所配置菌液实际浓度。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第43页菌悬液制备（使用麦氏比浊管）【使用技巧】1、直接用眼睛看（需要经验，误差较大）。2、找张白纸打上平行直线，利用光在不一样浓度液体折射不一样帮助观察比较。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第44页123456786×1086×1076×1066×1056×1046×1036×1026×101麦氏1号管稀释梯度表（cfu/ml）医疗器械检化员微生物培训专家讲座第45页菌悬液制备（使用分光光度仪）分光光度仪

医疗器械检化员微生物培训专家讲座第46页菌悬液制备保留菌悬液制备：菌悬液制备后应在2小时内使用，若保留在2～8℃菌悬液能够在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定孢子悬液保留在2～8℃，在验证过贮存期内替换对应量新鲜孢子悬液使用。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第47页培养基质量控制：灵敏度检验

灵敏度检验所需六种菌：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]ATCC6538铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]ATCC9027枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]ATCC6633生孢梭菌[CMCC(B)64941]ATCC11437白色念珠菌[CMCC(F)98001]ATCC10231黑曲霉[CMCC(F)98003]ATCC16404依据培养基功效选择灵敏度试验所需菌种医疗器械检化员微生物培训专家讲座第48页中国药典年版明确要求：培养基灵敏度、微生物程度检验法检验所用菌株传代次数不得超出5代（从菌种保留中心取得冷冻干燥菌种为第0代），并采取适宜菌种保藏技术，以确保试验菌株生物学特征。培养基质量控制：灵敏度检验医疗器械检化员微生物培训专家讲座第49页中国药典年版在新增“药品微生物试验室规范指导标准”中对菌种有了较为明确要求：允许使用标准菌株和商业派生菌株标准菌株应按保藏机构提供说明进行复活标准贮备菌株应进行纯度和特征确认标准贮备菌株提议采取低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻保藏方法标准贮备菌株可用于制备每个月或每七天一次转种工作菌株冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用工作菌株不可替换标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株培养基质量控制：灵敏度检验医疗器械检化员微生物培训专家讲座第50页菌株传代基本概念标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏，遗传学特征得到确认和确保并可追溯菌株。（0代）标准贮备菌株：由标准菌株经一次传代得到培养物。（1代）商业派生菌株：由供给商提供全部特征与标准菌株等效菌株。（2代）工作菌株：由标准贮备菌株经传代得到培养物。（2代）代：将活微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第51页采购第2代超低温冷冻标准贮备菌种工作菌种第3代工作菌种第3代工作菌种第4代工作菌种第4代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代制备工作菌种进行菌种保藏模式图医疗器械检化员微生物培训专家讲座第52页各类菌种保藏条件及时间

菌种培养基保留温度传种时间细菌普通多用于营养琼脂或依据菌种要求选取培养基4~6℃芽孢杆菌3~6个月，其它细菌每个月酵母菌普通用麦芽汁琼脂或麦芽汁酵母膏琼脂4~6℃普通4~6个月丝状真菌普通用PDA琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等4~6℃每4个月移植一次（每2个月移植一次）医疗器械检化员微生物培训专家讲座第53页

菌种保管

•菌种保管应有专员负责，保留与加锁冰箱中或特制白铁箱中加锁置阴暗处，确保菌种安全。因工作变动时，必须做好交接工作。•菌种应有详细登记本，包含名称、分离日期、判定日期、判定者、主要判定性能，并注意统计使用、转移及销毁情况和原因。•各种菌种应按要求时间定时移种。普通每移种3次后作一次全方面判定。注意菌种有没有污染和变异，如发觉污染和变异时，应及时更换。•购置菌种，应有介绍信。全部保留菌种应具备清单，并定时向部门责任人汇报。

医疗器械检化员微生物培训专家讲座第54页FTM灵敏度检查培养基标准菌种(10-100cfu/ml)30～35℃培养培养天数12345FTM(12ml)金黄色葡萄球菌管1管2緑脓杆菌管3管4枯草芽孢杆菌管5管6生胞梭菌管7管8空白对照管9医疗器械检化员微生物培训专家讲座第55页培养基质量控制：灵敏度检验接种金黄色葡萄球菌、緑脓杆菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24h；用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml菌液备用。接种生胞梭菌新鲜培养物至硫乙醇酸盐液体培养基中，30～35℃培养18～24h；用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml菌液备用。接种白色念珠菌新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，23～28℃培养24～48h；用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml菌液备用。接种黑曲霉新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7d,加3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml孢子悬液备用。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第56页菌种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉；制备成活菌数＜100cfu菌悬液备用菌株传代次数不得超出5代培养基接种每种菌接种至2管对应培养基，另取一支不接种作空白对照，按要求温度时间培养。结果判断空白对照管应无菌生长，每种菌接种后2管培养基管均生长良好，该培养基灵敏度检验符合要求。培养条件金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌接种至营养肉汤（或营养琼脂培养基）30～35℃培养18～二十四小时；生孢梭菌接种至硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养3天；白色念珠菌、黑曲霉接种至改良马丁培养基中23～28℃培养5天培养基质量控制：灵敏度检验医疗器械检化员微生物培训专家讲座第57页培养基质量控制：无菌检验每批灭菌培养基随机取不少于5支(瓶)，培养14天，应无菌生长。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第58页无菌试验医疗器械检化员微生物培训专家讲座第59页无菌试验预防假阳性办法1在一个专门准备、环境控制房间内层流罩环境中进行测试2在整个测试过程中使用无菌技术3用防止污染方法把测试器皿、培养基和测试物品引入测试区4测试产品表面细菌污染，在引导测试物品进入测试区之前，先对产品外包装进行消毒。5对测试中使用设备、材料和产品进行灭菌6简化进行测试必须操作7尽可能防止悬浮微粒产生8环境时时监测（沉降菌检测）医疗器械检化员微生物培训专家讲座第60页无菌试验相关标准GBT19973.2--医用器材灭菌微生物学方法第二部分：确认灭菌过程无菌试验ISO11737-2-医用器材灭菌微生物学方法第二部分：确认灭菌过程无菌试验医疗器械检化员微生物培训专家讲座第61页无菌试验：培养条件不论哪种无菌试验方法：FTM32.5±2.5℃，不少于14天；SCDB22.5±2.5℃，不少于14天；改良马丁23-28℃，不少于14天。假如14以内观察到阳性结果，无须继续培养。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第62页无菌试验阳性对照应依据供试品特征选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主供试品．以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗霉菌供试品，以白色念珠菌为对照菌。加菌量小于l00cfu，供试品用量同供试品无菌试验时每份培养基接种样品量。阳性对照管培养48～72小时应生长良好．医疗器械检化员微生物培训专家讲座第63页阴性对照阴性对照：阴性对照供试品无菌试验时，应取对应溶剂和稀释同法操作作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第64页无菌试验：结果判断肉汤培养基有菌生长常见三种形式：混浊生长：液体变混浊。菌膜：液体澄清，表面有一薄层菌膜。沉淀生长：液体澄清，管底有沉淀物医疗器械检化员微生物培训专家讲座第65页混浊生长：液体变混浊医疗器械检化员微生物培训专家讲座第66页肉汤培养基有菌生长常见形式医疗器械检化员微生物培训专家讲座第67页无菌试验：结果判断1.阳性对照管应生长良好，阴性对照管应无菌生长2.培养期间逐日观察并统计是否有菌生长，如培养14天后，培养基出现浑浊，但不能确定是否有微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基或划线接种于斜面培养基上，细菌培养两天，霉菌培养三天，观察接种同种新鲜培养基是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第68页释出物检验

医疗器械检化员微生物培训专家讲座第69页无菌试验验证：释出物检验目标：对未知或可疑供试品，在进行无菌试验试验前进行方法验证试验，以确认供试品在该试验条件下无抑菌活性或其抑菌活性能够忽略不计。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第70页无菌试验验证：释出物检验取灭菌产品以无菌操作转移到培养基中,30-35℃培养24hrs；

注意：使用与实际无菌试验同种等量培养基接种每毫升浓度小于100cfu菌种稀释液在无菌培养基内，一式两份，其中一份加入无菌试样，另一份作为阳性对照，并在适当温度培养不超出5天。按表1所列菌种重复以上步骤。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第71页无菌样品100cfu菌种＋无菌样品试验组对照组释出物检查在适当温度培养不超出5天。选择适当微生物，重复以上步骤。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第72页释出物检验解释：经过与阳性对照对比，假如在培养容器内看不到微生物生长，则说明使用样品能抑止细菌或霉菌生长。能够考虑使用无菌中和剂，如吐温80、卵磷脂、偶氮植物凝血素、β-内酰胺酶。假如中和剂无效，增加培养基量。尽可能使用能使试验微生物生长最小培养基量。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第73页大豆酪蛋白消化物培养基(SCDM)菌种培养温度培养条件培养时间枯草芽孢杆菌ATCC663322.5±2.5º需氧3天白色念珠菌ATCC1023122.5±2.5º需氧3-5天释出物检验惯用菌种医疗器械检化员微生物培训专家讲座第74页初始污染菌医疗器械检化员微生物培训专家讲座第75页定义生物负载：一件产品和/或包装上存活微生物总数。生物负载预计值：经过对活菌计数或灭菌前活菌计数加上一个回收效率赔偿系数，得出组成生物负载微生物数值。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第76页初始污染菌相关标准GBT19973.1--医用器材灭菌微生物学方法第一部分产品上微生物总数预计ISO-11737-1:GBT19973.1--医用器材灭菌微生物学方法第一部分产品上微生物总数预计医疗器械检化员微生物培训专家讲座第77页样品份额取样标准

1定义：样品份额(SIP)sampleitemportion，即从某一保健产品单元上取出用于试验部分。2取样注意事项2.1若可操作，试验应使用整个产品单元。但这往往被认为是不可行，产品单元上样品份额宜在试验室易于操作前提下尽可能大。2.2假如所用样品份额((SIP)小于一个完整产品单元，则应选择代表产品单元含有微生物部分。假如已验证微生物在产品单元上是均匀分布，应从产品单元上任一部位选择样品份额。在缺乏这些验证情况下，应从产品单元上随机选择几个部分作为样品份额。2.3样品份额本身应对产品单元内产品有代表性。当产品分成不一样部分，能够分装于两个或多个容器内。样品份额能够依据供试产品单元长度、质量、体积或表面积。假如产品单元有标签说明只是液路无菌，宜把液路视为整个试验单位。(即SIP=1)2.4SIP选择举例，见表1医疗器械检化员微生物培训专家讲座第78页表1SIP选择举例选择SIP依据标准样品表面积放植物(非吸收)质量粉状、手术衣/单、植入物(可吸收)长度管路(直径不变)管路(直径不变)体积水、液体液路静脉输注器，液袋医疗器械检化员微生物培训专家讲座第79页表1SIP选择举例选择SIP依据标准样品表面积放植物(非吸收)质量粉状、手术衣/单、植入物(可吸收)长度管路(直径不变)管路(直径不变)体积水、液体液路静脉输注器，液袋医疗器械检化员微生物培训专家讲座第80页校正因子医疗器械检化员微生物培训专家讲座第81页校正因子定义：用于对活菌计数或灭菌前活菌计数进行修正数值，以赔偿产品上无法完全洗脱微生物，方便计算出生物负载预计值。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第82页校正因子重复洗脱方法试验步骤1取样品1件或sip，投入一定量无菌洗脱液中(A)。2样品处理采取旋涡混台器(2800次／min)，振荡2min。3注皿：取处理洗脱液A2ml，分别注入两个无菌平皿中，每平皿1ml。4再洗脱:将样品从洗脱液A中取出沥干，移入另一定量无菌洗脱液中(B)。5再处理:将B洗脱液置旋涡混台器(2800次／min)振荡2min。6再注皿:取B洗脱液2ml，分别注入两个无菌平皿内，每平皿lml。注：当微生物数少时,从B洗脱液开始，即可用无菌滤膜过滤后直接放培养基中培养。7如此重复洗脱4次．即A、B、C和D，直至洗脱累积量(初始污染菌)不再增加，最终沥干样品，将其平铺于无菌平皿中(E)。然后将熔化并冷至45～48℃NA培养基，分别注入A～E各平皿每皿15ml。8待凝固后，放置在要求培养条件下(30～35℃，48h～82h)培养，进行活菌计数。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第83页校正因子=1/0.3825=2.61

编号平皿均数×稀释倍数琼脂覆盖总数回收率％洗脱1洗脱2洗脱3洗脱4平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均180010003001008220836.23260080020005160537.3837006002002002170241.13平均38.25校正因子计算医疗器械检化员微生物培训专家讲座第84页校正因子计算同批产品，需抽取3-5件，进行重复性试验，确定最小、最大及平均回收率和初始污染菌数。依据校正因子，灭菌前初始污染计数乘以校正因子即为产品带菌总数。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第85页初始污染菌方法验证检验洗脱液有没有抑菌作用检验样品有没有抑菌作用医疗器械检化员微生物培训专家讲座第86页无菌洗脱液＋初始污染菌样品＋100cfu菌种1.试验组3.样品对照组初始污染菌方法验证（药典）在3次独立平行试验中:洗脱液对照组(4)菌回收率应均不低于70%。（4/2）×100％试验组(1)菌回收率应均不低于70%（1-3）/2×100％2.菌液组4.洗脱液对照组100cfu/ml菌种无菌洗脱液＋初始污染菌样品无菌洗脱液＋100cfu菌种医疗器械检化员微生物培训专家讲座第87页初始污染菌方法验证（ISO11737）选取灭菌产品，假如洗脱技术中用到洗脱液，每一产品都应经受常规微生物洗脱技术，则将一定数量易受破坏微生物放人洗脱液中，回收微生物。选取灭菌产品，假如产品直接放人培养基中，能够参考无菌试验抑菌试验进行。医疗器械检化员微生物培训专家讲座第88页灭菌产品＋100cfu菌种常规洗脱回收细菌数100cfu/ml菌种1试验组2对照组试验组回收细菌数/对照组菌数×100％≥70％初始污染菌方法验证（ISO11737）医疗器械检化员微生物培训专家讲座第89页微生物试验试验前试验中试验后环境控制培养基质量灭菌控制人员控制无菌操作方法验证灵敏度试验无菌检验无菌试验初始污染菌B/F验证洗脱液验证样品无抑菌作用仪器校正沉降菌检测简化操作医疗器械检化员微生物培训专家讲座第90页物体表面细菌总数

医疗器械检化员微生物培训专家讲座第91页物体表面细菌总数方法：将内径为5cm×5cm灭菌规格板，放在被检物件体表面，依据物体表面积大小，采平行样l