糖生物学基础理论

糖生物学基础理论第1页/共175页糖、聚糖、糖复合物（研究生班）第2页/共175页

序言一、糖生物学（glycobiology）正在成为生命科学的新前沿二、糖基化作用（glycosylation）与糖化作用（glycation）

第3页/共175页（一）“糖生物学”概念的提出：

1988年DwekR.A（牛津大学教授）AnnuRevBiochem1988;57:785-838Glycobiology.RademacherTW,ParekhRB,DwekRA.DepartmentofBiochemistry,UniversityofOxford,England.PublicationTypes:ReviewReview,Academic

糖生物学是以糖链为“生物信息分子”的水平上阐明多细胞生物的高层次生命现象的一门学科。第4页/共175页G.W.Hart（美国著名糖生物学家）：

“生物化学中最后一个广袤前沿——糖生物学的时代正在加速来临。”

（1993年5月在美国旧金山召开的首届《国际糖生物学工程会议》

“人类疾病的新前景”

（1993年9月美国NIH召开〈首届糖生物学会议〉）

“糖生物学是生物化学和生物医学交叉点的新前沿”

（1994年美国〈第二届糖生物工程会议〉）

第5页/共175页（二）糖生物学研究中的一场革命

1990年11月，3个不同研究小组几乎同时发现血管内皮细胞-白血球粘附分子（ELAM-1，后改称为E-选择素，E-selectin），这种分子能识别白血球表面唾液酸化四聚糖sia-Lex（

Sia-Gal-Fuc-GlcNAc

），它是一种血型抗原。这是首次真正在人体内确证了炎症过程有糖类和相关的糖结合蛋白参与。

更令人吃惊的是——

第6页/共175页

在肺癌细胞和结肠癌细胞表面也发现同样的四糖（sia-Lex）。可能同样的机制导致肿瘤的转移。继之，产生以该研究成果被产业化的热潮，“糖工程”（glycotechnology）也运应而生。“糖工程”研究的是糖生物学的方法论和基本技术，以及把基础研究获得的知识进一步转化为生产技术等。

1998年在德国召开的国际糖生物学讨论会上又更改为糖生物工程（glycobiotechnology）。第7页/共175页（三）发达国家政府对糖生物学研究的支持：

英国：牛津大学RaymondDwek教授曾在1988年在“生化年鉴”上发表了题为《Glycobiology》的综述，开创了“糖生物学”研究的新纪元。

1991年牛津大学创刊了《Glycobiology》专业杂志

1992年建立糖生物学研究所。日本：1989年，创办“糖科学与糖工程动态”杂志，同年政府提出“糖工程基础与应用研究推进战略”，并实施“糖工程前沿计划”，该计划包括：糖工程、糖分子生物学和糖细胞生物学，总投资达百亿日元。第8页/共175页

美国：1986年，政府资助佐治亚大学创建“复合糖类研究中心”（CCRC），并建立数据库和提出“糖库计划”。每二年召开一次“糖工程”会议，明确提出”生物化学中最后一个重大前沿，糖生物学的时代正在加速来临。

欧盟：1994-1998年间也提出了“欧洲糖类研究开发网络”计划，企图在该领域的基础研究与产业化开发上与美、日抗衡。第9页/共175页（四）重大突破和与现代医药学的密切关系1、糖类作为信息分子在受精、发生、发育、分化，神经系统和免疫系统衡态的维持等方面起重要作用。2、炎症和自身免疫疾病、衰老、癌细胞的异常增殖与转换和病原体感染等生理和病理过程都有糖类的介导。

21世纪生命科学的研究焦点是对多细胞生物的高层次生命现象的解释，因此糖类研究必将成为生命科学的新前沿。第10页/共175页二、糖基化作用（glycosylation）与糖化作用（glycation）

糖基化作用是指单糖、寡糖或多糖链可由酶催化与蛋白质或脂类等非糖物质的特定部位共价结合形成糖复合物的过程。

第11页/共175页

糖化作用是由还原糖上的-CHO基与蛋白质或核酸分子上的游离氨基间形成西夫氏碱，经过Amadori重排后生成早期糖化产物，再经过脱水和重排产生一些带有棕黄色荧光的晚期终末糖化产物（advancedglycatedendproducts,AGE）的过程，所以也称非酶糖化反应或Millard反应。第12页/共175页

参考书AjitVark,etal:

“EssentialsofGlycobiology”陈惠黎等：“糖复合物的结构和功能”方福德等：“分子生物学前沿技术”第13页/共175页

糖的化学

（chemistryofcarbohydrate)一、单糖分子结构特点

（一）构型D型和L型：定位编号最高的手性碳原子的构型与甘油醛比较，或D型或L型。第14页/共175页CHOH—C*—OHCH2OHCHOHO—C*—HCH2OHD-(+)-甘油醛L-(-)-甘油醛D-型和

L-型甘油醛的结构CHOH—C—OHHO—C—HH—C—HOH—C*—OHCH2OHCHOOH—C—HH—C—HOH—C—HOOH—C*—HCH3D-葡萄糖D-甘油醛L-岩藻糖糖开链结构CHOH—C*—OH

CH2OH第15页/共175页OOHHHOHOHHOCH2OHHH-D-葡萄糖OHOHOHHOHHOCH3HH-L-岩藻糖Haworth式结构OCH2OHHHHOOHHHHOHOHOHOHHOHHHOHHOH-D-葡萄糖葡萄糖椅型结构HHCH3-L-岩藻糖HOHC*———H—C—OH

HO—C—HOH—C—OHH—C*———CH2OH-D-葡萄糖-L-岩藻糖D-型葡萄糖环状结构HOH———C*HO—C—H

OH—C—OHH—C—OH———C*CH3第16页/共175页-构型和-构型：环状结构使C1位成为手性碳，C1位的半缩醛羟基与C5位的羟基处同侧为-构型，反之则-构型。HOHC*———H—C—OH

HO—C—HOH—C—OHH—C*———CH2OH-D-葡萄糖D-型葡萄糖环状结构HOHC*———H—C—OH

HO—C—HOH—C—OHH—C*———CH2OH-D-葡萄糖第17页/共175页OOHHHOHOHHOCH2OHHH-D-(+)-葡萄糖OOHHHOHOHHOHHH-D-(+)-葡萄糖D-型葡萄糖Haworth式结构OCH2OHHHHOOHHHHOHOHOCH2OHHHHOOHHHHOHOH-D-葡萄糖-D-葡萄糖葡萄糖椅型结构HCH2OH第18页/共175页OOHHHOHHHOCH2OHOHH-D-葡萄糖（Glc）OOHOHHHOHHOCH2OHHH-D-甘露糖（Man）OOHHHOHHHCH2OHOHHO-D-半乳糖（Gal）葡萄糖的立体异构体（二）立体异构体（三）衍生糖OHOHOHHHHHOHHOCH3L-岩藻糖（Fuc）OOHHHNH-CO-CH3HHOCH2OHOHHN-乙酰--D-葡萄糖胺（GlcNAc）OOHHHNH-CO-CH3HHCH2OHOHHON-乙酰--D-半乳糖胺（GalNAc）甲基糖类氨基糖类HHHHH第19页/共175页OOHHHOHHHOCOOHOHHOOHHHOHHHOCOOHOHHHH葡萄糖醛酸L-艾杜糖醛酸糖醛酸类CHOH|CHOH|CH2OHOHCOOHOHOHHHHHH3C-CO-NHHO-H3C-CO-NHCHOH|CHOH|CH2OHOHCOOHOHOHHHHHN-乙酰-神经氨酸（NeuAc）N-羟乙酰-神经氨酸（NeuGc）唾液酸类第20页/共175页二、单糖间的连接——糖苷键糖复合物的糖链，在其糖苷键的连接中，必有一个是半缩醛羟基，另一个醇羟基。按照半缩醛羟基是-或-，糖苷键可分为-糖苷键或-糖苷键，再标明其连接部位。如：第21页/共175页OOHHHNH-CO-CH3HCH2OHOHHN-乙酰--D-葡萄糖胺（GlcNAc）HOOHHHHCH2H-D-甘露糖（Man）H142356142365OOOHOHHHHHOCH2OHHH142365-D-甘露糖（Man）O还原端非还原端-1,4糖苷键-1,3糖苷键OH第22页/共175页糖链结构的复杂性：

核酸和蛋白质可以储存大量的生物信息，是以分子量大为基础，而糖类作为信息分子则是以其结构多样性为特征。单糖和氨基酸（核苷酸）形成异构体数目的比较单体种类和数目肽（多核苷酸）糖类异构体数目类异构体数目XXXYXXXXYZ113617610561216第23页/共175页三、自然界中糖类存在形式

游离糖：单糖（及其衍生物）、寡糖、聚（多）糖

结合糖（糖复合物或糖结合物）——指糖类与蛋白质（多肽）或脂类共价结合的复合物，如：糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂和脂多糖

近年来，发现的一类新的糖复合物，即由糖类、脂类和蛋白质三者组成，被称为糖基化磷脂酰肌醇蛋白（glycosyl-phosphatidylinositolprotein），简称GPI蛋白。这类结合蛋白通过GPI的脂肪酸插入膜脂双层的外层，被锚固在膜上。第24页/共175页NHCH2CH2O-O-P=OO

62Man1—2Man1—6Man1—4GlcNH21—O—

O

-O-P=OOCH2CH2NH2HOOHOHOHO-O-P=OO

CH2-CH-CH2R2R1O

O-C-(CH2)14-CH3R4R3—NH2-蛋白质-C=O+/-额外的磷酸乙醇胺+/-额外的棕榈酰基磷酸乙醇胺桥GPI蛋白模式示意图6R1和R2:饱和脂酸（少数不饱和）R3和R4:糖基或糖链第25页/共175页PPGlcNAcPGlcNH2第26页/共175页N第27页/共175页GPI蛋白质的分类：1、细胞表面的水解酶：碱性磷酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、二肽酶2、原虫外表的抗原蛋白：锥虫可变表面蛋白、疟原虫裂殖体表面蛋白抗原3、淋巴样抗原：脊椎动物脑和啮齿类动物胸腺细胞的Thy-1抗原4、粘着分子：神经原的NCAM-120、大鼠肝硫酸类肝素蛋白聚糖5、GPI化的小肽：小细胞肺癌的细胞表面一种抗原，可作为CD-24信号转导分子6、GPI相连的蛋白聚糖：glypicanMW=6.2万558个氨基酸残基含4条HS（硫酸肝素）糖链（3条在C端，1条在N端）7、其他：衰变加速因子（decayacceleratingfactor，DAF）、人癌胚抗原（CEA）第28页/共175页

GPI结合蛋白的主要生理功能一、与免疫及神经细胞活化二、与信息传递的关系三、与受体第29页/共175页糖蛋白（glycoprotein）一、糖蛋白糖链结构的特征（一）糖链与肽链的连接方式及其分型第30页/共175页OONHN-C-CH2-CHC=ONHC=OCH3CH2OHONHO-CH2-CHC=ONHC=OCH3CH2OHSer/Thr残基Asn残基-GlcNAc-GalNAc图3-1N-糖苷键和O-糖苷键连接方式OHOHN-连接（寡）糖链（简称N-糖链）O-连接（寡）糖链（简称O-糖链）第31页/共175页罕见的糖链与肽链的连接方式

连接方式举例N-乙酰氨基葡萄糖

—丝氨酸/苏氨酸细胞质和核中糖蛋白半乳糖基—羟脯氨酸阿拉伯半乳聚糖蛋白、藻类细胞壁糖蛋白半乳糖基—丝氨酸马铃薯凝集素、藻类细胞壁糖蛋白、地蚕表皮胶原甘露糖基—丝氨酸/苏氨酸酵母聚甘露糖真菌糖肽、

Clamworm表皮胶原L-岩藻糖—苏氨酸人尿糖肽、大鼠糖蛋白半乳糖—半胱氨酸（S-糖苷键）

人尿糖肽葡萄糖—半胱氨酸（S-糖苷键）

鳕变态反应原M、红细胞膜糖肽第32页/共175页（二）N-连接糖链和O-连接糖链

1、N-连接糖链的结构特点第33页/共175页ManManManManManManManManMan

GlcNAcGlcNAc

AsnN-连接寡糖的分型高甘露糖型

SASAGalGalGlcNAcGlcNAc

ManManMan

GlcNAcGlcNAcAsnFucGlcNAc杂交型复合型GalGlcNAc

ManManMan

GlcNAcGlcNAcAsnGlcNAcManMan1,41,41,31,61,41,41,41,41,31,61,61,31,41,41,6第34页/共175页N-连接糖链的核心五糖区结构第35页/共175页SAGalSASAGlcNAcGalGalManGlcNAcGlcNAcMan

GlcNAcGlcNAc

AsnSAGalGlcNAcManMan

GlcNAcAsnGal

GlcNAc

几种特殊的N-连接糖连结构

A：大鼠肝细胞膜糖蛋白的糖肽

B：人红细胞膜唾液酸糖蛋白的糖肽

第36页/共175页带有血型物质的复杂型N-连接糖链第37页/共175页2、O-连接糖链的结构特点（1）O-GalNAc糖链（2）O-GlcNAc糖链第38页/共175页Gal1

3GalNAc--Ser/ThrGal1GlcNAc1GlcNAc13GalNAc--Ser/ThrGlcNAc1GlcNAc1GlcNAc13GalNAc--Ser/ThrGlcNAc1

3GalNAc--Ser/ThrGalNAc--Ser/Thr36GalNAc--Ser/Thr36常见O-GalNAc糖链的核心结构第39页/共175页O-GlcNAc糖链特点1、仅存在于细胞质和细胞核中2、糖基化位点只连接有1个GlcNAc糖基3、糖基化处动态平衡第40页/共175页OCH2OHHHAcNHOHHHOHOH-D-葡萄糖OCH2OHHHAcNHOHHHOHOH-D-葡萄糖—Tyr—Ser—Pro—Thr—Ser—Pro—Ser—O-GlcNAcTransferaseO-GlcNAcaseO-GlcNAc结构图解第41页/共175页ProtenGlcNAcUDP[3H]Gal+ProtenGlcNAc[3H]GalUDP+Galactosyltransferase第42页/共175页NEUCLEARPROTEINSNuclearporeproteinsRNApolymeraseIIManytranscriptionfactorsC-Myconcoproteinv-Erb-aoncoproteinP53tumorsuppressorSV40TantigenTyrosinephosphataseManychromatinproteinsEstrogenreceptorsFungalDNA-bindingproteins

已确定的Ｏ－GlcNAc

糖基化蛋白质（１）

第43页/共175页CYTOSKETETALPROTEINSCytokeratins13，8，18neurofilamentsH，M，LhumanerythrocyteBand4.1SynapsinImanysynapticvesicleproteinsMAPstauTalinvinculinClathrinassemblyproteinAP3Apasia已确定的Ｏ－GlcNAc

糖基化蛋白质（２）

第44页/共175页OTHERPROTEINS92-KDSerproteinP43/hnRNPadenovirusfiberhumanCMVUL32rotavirusN526proteinbaculovirusgp41tegumentproteinp67translationredulationproteinmalarialproteinstrypanosomeproteinsgiardiaproteinsE.Histolyticaproteinsschitosomeproteins已确定的Ｏ－GlcNAc

糖基化蛋白质（3）

第45页/共175页（三）糖基化位点第46页/共175页

N-糖链的糖基化位点特异的氨基酸序列（也称序列子）：Asn–X-Ser/Thr

X

可以是Pro以外的任何氨基酸。序列中X位氨基酸的性质可能与合成的糖链结构有关。

极性氨基酸——复杂型糖链非极性氨基酸——高甘露糖型糖链第47页/共175页糖基化位点和肽链氨基酸序列OCH2OHNHC=OCH3OH-GlcNAc第48页/共175页S/L-S*-T*-T*-E/G-V-A-M-H-T*-T*-T*-S*-S-S-V-S*-K-S*-O-GalNAc糖链的糖基化位点人红细胞膜上血型糖蛋白A的N-端序列与糖基化位点特点：1、分子表面

2、Ser/Thr比较集中的序列第49页/共175页

常见四类O-GalNAc糖基化位点序列结构

1、-T-X-X-X-，其中有1个X为Thr2、-X-P-X-X-X-，其中有1个X为Thr3、-X-X-T-X-，其中有1个X为碱性氨基酸残基4、-S-X-X-X-，其中有1个X为Ser第50页/共175页（四）糖链的微观不均一性（糖型）糖蛋白分型

A型———————非糖蛋白

B型——高甘露糖型

C型——复杂型

D型——复杂型注：BP-RNase的34位上N-糖链结构差异牛胰核糖核酸酶（BP-RNase）第51页/共175页IgG的Fc段Asn297上可能有30余种糖链结构注：S—唾液酸G—半乳糖N—N-乙酰氨基葡萄糖

M—甘露糖F—岩藻糖S-G-N-MF

N-M-N-N-AsnS-G-N-MS-G-N-MF

N-M-N-N-AsnG-N-MG-N-MFN-M-N-N-AsnG-N-MS-G-N-MFM-N-N-AsnS-G-N-MS-G-N-MFM-N-N-AsnG-N-MG-N-MFM-N-N-AsnG-N-MG-N-MFM-N-N-AsnN-MMFM-N-N-AsnN-MN-1N-2N-10N-15IgG糖链多种可能的结构第52页/共175页二、糖链的生物合成（一）基本特点（供体、受体和糖基转移酶）

1、糖基供体

核苷酸形式如：UDP—（Glc、GlcNAc、Gal、GalNAc、

Xyl、Ara、GlcUA和IduUA）

GDP—（

Man和Fuc）

CMP—（NeuAc）

磷酸长（多）萜醇（dolichol，Dol）如：Dol-P-P—（

Man、Glc和GlcNAc）第53页/共175页磷酸长（多）萜醇的合成过程：乙酸HMGCoA异戊烯焦磷酸法尼基焦磷酸多萜醇磷酸多萜醇

CH3CH3CH3

CH3-C=CH-CH2-[CH2-C=CH-CH2]n-CH2-CH-CH2-CH2-O-P-O-糖基

（n=15-19）

磷酸长萜醇结构式第54页/共175页2、受体

糖基第一受体通常是肽链中特定氨基酸残基。

糖链延长时，新接上糖基的几个羟基都可以是下一糖基的接受体，可形成分支。3、糖基转移酶第55页/共175页N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶（GlcNAcT）种类功能特点糖基供体1I2II3III4IV5V6VI78五糖核心区的GlcNAc的转移

五糖核心区内不同Man或同一Man上不同位置的GlcNAc的转移

外围链Gal上GlcNAc的转移，进而形成重复的(Gal-GlcNAc)n的结构Dol-P-P-GlcNAcUDP-GlcNAc第56页/共175页Man14GlcNAc-643GlcNAcT-IGlcNAc1GlcNAcT-IIGlcNAc1GlcNAcT-IIIGlcNAc1GlcNAcT-IVGlcNAc1GlcNAcT-VGlcNAc1GlcNAcT-VIGlcNAc1Man1Man164242五糖核心区第57页/共175页（二）N-糖链的生物合成

（内质网和高尔基体，两个阶段，为伴翻译）第一阶段：G-寡糖-脂质中间体的合成和转移（内质网）第二阶段：糖链的后加工和各型N-糖链的成熟（内质网和高尔基体）第58页/共175页GlcGlcGlcManeMangMani

MandManfManh

ManbMancMana

GlcNAc

GlcNAc

-P-P-DolG-寡糖的结构(Glc)3(Man)9(GlcNAc)2-P-P-Dol1,21,31,31,21,21,21,21,31,61,61,31,41,4第59页/共175页G-寡糖-脂质体合成示意图GDP-Man+P-DolMan-P-Dol+GDPUDP-Glc+P-DolGlc-P-Dol+UDP反应（1）反应（2）第60页/共175页G-寡糖合成的基本特点：

1、第一个Man是-异头体连接，其余Man均为-异头体连接，方式可以是13，或16和12。

2、前5个Man供体都是GDP-Man，后4个Man供体为Dol-P-Man，反应在内质网膜的两侧进行。

3、末端3个Glc有两种连接方式，即13或12。

4、衣霉素（tunicamycin）可以抑制G-寡糖的合成。第61页/共175页衣霉素的结构N-乙酰葡萄糖胺尿苷第62页/共175页(Glc)3(Man)9(GlcNAc)2——(Glc)3(Man)9(GlcNAc)2——AsnP-P-Dol寡糖转移酶---Asn---第63页/共175页1、高甘露糖型糖链的成熟（1）切除3个Glc后，剩余部分Man即可，如：大豆凝集素（2）根据需要切除部分Man（次序是g、e、i、d和f、h），在通过ManT连接必要的Man形成各种高甘露糖型糖链。ManeMangMani

MandManfManh

ManbMancMana

GlcNAc

GlcNAc

-P-P-Dol1,21,21,21,21,31,61,61,31,41,4GlcGlcGlc

第64页/共175页2、杂合型糖链的成熟

切除g、e、i、d后，在b位接上(GlcNAc-Gal)n和NeuAc，并可形成分支。ManfManh

ManbMancMana

GlcNAc

GlcNAc

-P-P-Dol1,31,61,61,31,41,4(Glc)3

第65页/共175页3、复杂型糖链的成熟切除g、e、i、d位Man，在b位Man上连接(GlcNAc-Gal)n和NeuAc后，可形成分支。再进一步切除f和h位Man，并连接(GlcNAc-Gal)n和NeuAc，也可形成分支。

ManbMancMana

GlcNAc

GlcNAc

-P-P-Dol1,61,31,41,4(Glc)3

第66页/共175页高甘露糖型糖链的成熟杂合型和复杂型糖链的成熟第67页/共175页第68页/共175页

糖链合成的终止信号——一般认为外围链的-Fuc

或-NeuAc（三）O-糖链的生物合成

（主要在高尔基体，芽生式合成，为翻译后加工）（四）溶酶体酶的糖基化

（Man-6-P识别信号）第69页/共175页ManeMangMani

MandManfManh

ManbMancMana

GlcNAc

GlcNAc--Asn--1,21,21,21,21,31,61,61,31,41,4第70页/共175页Man-6-P生成反应：ManMan6-P-GlcNAcMan-6-PGlcNAc磷酸转移酶第71页/共175页三、糖链的降解和代谢病降解场所:溶酶体内降解方式：（一）N-糖链的降解第72页/共175页含N-糖链的肽链一定长度含N-糖链的肽片段（糖肽）切除五糖核心区的FucN-糖链-GlcNAcGlcNAc-Asn各种单糖基及其衍生物GlcNAc+肽片段各种氨基酸+蛋白水解酶部分蛋白肽链降解在先岩藻糖苷酶GlcNAc酶F各种外切糖苷酶肽-N-聚糖水解酶F（PNG酶F，

peptide-N-glycanaseF)专一性水解酶第73页/共175页（二）O-糖链的降解视糖链的多寡而言。一般糖链不多者，糖链和肽链降解同时进行；糖链较高者，则糖链降解进行在前，尤其是NeuAc，肽链降解在后。第74页/共175页（三）糖链增多症

也称溶酶体贮积性疾病（lysosomalstoragediseases），大多数为常染色体隐性遗传病。其原因可能是：酶蛋白合成的缺陷酶蛋白不能糖基化或磷酸化，不能定向投送到溶酶体投送到溶酶体过程中，出现异常，如Man-6-P受体结合能力变弱第75页/共175页与二天线N-糖链降解有关的糖链增多症及其相关酶的缺陷第76页/共175页四、糖蛋白糖链的生物学功能（一）常用的研究策略（１）比较不同糖链的同种糖蛋白的生物学活性。（２）应用内切和外切糖苷酶观察糖链或糖链中某些糖基的生物学功能。（３）应用糖链合成或加工抑制剂，可在细胞水平研究整条糖链的生物学功能，或研究不同糖链类型对糖蛋白代谢和功能。

第77页/共175页主要抑制剂：ａ衣霉素（tunicamycin）抑制整条Ｎ－糖链的合成ｂcastanospermine(CS)ｃdeoxynojirimycin(DNM)ｄdeoxymannojirimycin(DMM)eswainsonie(SW)抑制-葡萄糖苷酶Ｉ和II抑制-甘露糖苷酶Ｉ和II第78页/共175页（４）应用基因DNA定点突变技术，研究整条糖链功能：

为维持蛋白质构象不改变，糖基化位点氨基酸拟以相同性质氨基酸取代较妥。（５）应用糖基转移酶的基因工程技术，可以观察糖链加工的某过程发生障碍和某一糖基缺失，或过度表达时对糖链生物学功能的影响。

常用基因剔除（knockout）、反义核酸封闭或转基因技术。第79页/共175页（６）利用糖基化过程不同步骤异常的细胞突变株，根据细胞行为的改变来研究不同结构糖链的功能。例如：中国仓鼠卵巢细胞（CHO）的Lec1和４株，分别缺失GlcNAcTII和V，Lec29和30则可过度表达1，3FucT。例如：幼仓鼠肾细胞（BHK）的RicR15和19株，是缺失-甘露糖苷酶II的细胞株。

第80页/共175页（二）寡糖链的主要功能

1、在维持糖蛋白分子构象及其细胞内转运中的作用

（1）影响新生肽链正确折叠和亚基聚合

举例（1）：

G-寡糖链中3个Glc基对肽链折叠至关重要。(Man)9(GlcNAc)2-AsnUDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基转移酶UDP-GlcUDPGlc-(Man)9(GlcNAc)2-Asn

（单葡萄糖十二糖基糖链）第81页/共175页

内质网上钙连蛋白（calnexin）为凝集素样蛋白，具分子伴侣作用可以识别上述单葡萄糖十二糖基糖链，并与之结合，引导肽链正确折叠。然后，钙连蛋白脱离糖蛋白，同时Glc又被葡萄糖苷酶水解去除，糖链继续加工成熟。

举例（2）：

运铁蛋白（transferrin,Tf）受体蛋白肽链的Asn-251、317和727分别为3条N-糖链，但是其功能各不相同。Asn-251为三天线复杂型，它的缺失使Tf受体不能形成二聚体，从而影响受体的投递和功能。Asn-727是高甘露糖型，带磷酸基，在肽链折叠和运送中起重要作用。第82页/共175页举例（3）：

纤连蛋白（fibrinectin,Tn)受体正常功能形式为二聚体（如51），经天冬酰胺酶F（即PNG酶F）或GlcNAc酶F处理，即不能形成二聚体，从而丧失功能。ManbMancMana

GlcNAc

GlcNAc

——Asn——天冬酰胺酶FGlcNAc酶F第83页/共175页

其可能的原因：a糖链是维持亚基正确构象所必需的，亚基的正确构象又是其聚合的基础。B亚基上存在糖链结合区，可以识别和结合另一亚基的糖链。C亚基间糖链和糖链的相互作用。第84页/共175页Asn297Asn297CH2CH2CH3CH3a`b`c`ggc`c`IgG中Fc段Asn297上两条N-糖链的相互作用细线为肽链，粗线为糖链，CH2：Fc段中恒区重链第2结构域，a`、b`、c`为糖链的外围链，g为核心五糖部分第85页/共175页

（2）在细胞内转运和防止其降解中的作用

举例（1）：

7721肝癌细胞经衣霉素处理后，细胞表面Tf受体明显减，少，但是受体合成并不受阻。这说明Tf受体蛋白的分拣和投送过程受到影响。

举例（2）：

衣霉素不能改变CHO细胞表面血型糖蛋白含量，但是可以使缺失O-GalNAc糖基化的CHO细胞突变株表面glycophorin含量明显减少，说明不仅N-糖链可以影响糖蛋白在细胞内转运，而且O-糖链也可以起到同样的作用。第86页/共175页抑制糖基化对糖蛋白在细胞内分泌的影响糖蛋白细胞分泌IgGIgMIgA28%抑制85%抑制64%抑制举例（3）：第87页/共175页糖修饰对糖蛋白的稳定性的影响糖蛋白含糖量处理保留糖量稳定性（%）（%）葡萄糖氧化酶酵母表面核酸酶鼠干扰素葡萄糖淀粉酶I1250高碘酸氧化内切-GlcNAc苷酶衣霉素高碘酸氧化4.85**仅存在变性剂的情况下第88页/共175页2、免疫屏障作用

免疫屏障作用——是指阻止肽链中一些抗原决定簇被免疫系统识别而产生抗体的功能。

例如：

使用E.Coli表达的无糖链的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）可使部分患者产生抗体。

原因是其相应的抗原决定簇恰好位于肽链中原O-GalNAc糖基化位点。糖基化使该抗原决定簇被掩盖。

第89页/共175页

此外，免疫屏蔽作用还表现糖链末端糖基可以阻断糖链其余部分产生抗体。

例如：

IgG的N-糖链末端缺乏Gal时，即暴露GlcNAc可产生自身抗体，与类风湿性关节炎等自身免疫性疾病有关。第90页/共175页3、寡糖链与蛋白质活性关系密切

部分酶为糖蛋白，糖链不仅在酶蛋白构象形成、转运和防止水解等方面起十分重要的作用，而且部分酶催化活性必须依赖其糖链。例如：

（1）在原核细胞中表达的溶酶体-葡萄糖苷酶，只能表现免疫原性，但完全没有酶的催化活性。（2）HMG-CoA还原酶在去糖基化后，其催化活性可降低90%以上。第91页/共175页

（3）脂蛋白脂酶的N-寡糖链的五糖核心是其催化活性所必需，而其外围链部分则对催化活性作用不大。

其原因可能是糖链改变了酶分子的疏水性、电荷性质、溶解度和粘性等，通过影响酶蛋白分子的构象及其稳定性来改变酶的活力。此外，某些蛋白质或激素的生物学活性也与其糖链结构关系密切，

第92页/共175页例如：

人促红细胞生成素（humanerythropoietin，EPO）是一种糖蛋白，由165个氨基酸残基组成，其肽链第24、38和83位连接有N-糖链，第126位是O-糖链。研究表明当其基因在原核细胞中表达，所得的产物没有生物学活性；而在哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达的产物就有活性，但也有明显差异。

原因是各种表达细胞中翻译过程或翻译后的糖基化加工修饰不同。据研究发现其分子肽链中N-糖链是活性所必需，第38位上的N寡糖链与分泌关系密切。第93页/共175页4、在细胞识别中的作用（1）在细胞受体-配体结合中的作用

a、糖基介导的细胞吞噬作用

例如：血浆铜蓝蛋白（每分子约含10个NeuAc）。当除去其中2个NeuAc，血浆铜蓝蛋白的半衰期从45分钟降至3-5分钟。当采用NeuAc基转移酶有重新接上末端NeuAc，其半衰期可得到恢复。当用-半乳糖苷酶或半乳糖氧化酶去除或破坏其暴露的末端Gal（吞噬细胞识别的标志），有可使其半衰期得到延长。第94页/共175页第95页/共175页血清中的放射性（%）注射后时间（分）[64Cu]标记的天然的和修饰的家兔血清铜蓝蛋白从血循环消失的速度13521、铜蓝蛋白2、去唾液酸铜蓝蛋白3、氧化的去唾液酸铜蓝蛋白4a、[3H]双标记去唾液酸铜蓝蛋白4b、[64Cu]双标记去唾液酸铜蓝蛋白5、去唾液酸、去半乳糖铜蓝蛋白（摘自Morell,A.G.,etal,1968,J.Biol.Chem.,243,155）4a4b第96页/共175页（2）在激素-受体结合中的作用

例如：

a、HCG

大鼠卵巢的HCG受体蛋白肽链上有6个N-糖基化位点，当采用定点突变方法，将其中Asn173Gln后，HCG与其受体的结合能力将完全丧失；当将Asn77Gln和Asn152Gln后，可使其与受体的亲和力下降80%；如定点突变发生在Asn269、Asn277和Asn291，则其结合能力不受影响。第97页/共175页b、EPO

正如前述，EPO分子的糖链结构不同表现其生物学活性有明显差异，其原因除糖链与维持分子构象有关外，主要还是分子中N-糖链参与其与受体分子之间识别和相互结合过程。据报道含二天线N-糖链的EPO较四天线对配体的亲和力高3倍左右；仅剩五糖核心区N-糖链EPO约为完整N-糖链的5倍。第98页/共175页（3）在非激素受体-配体结合中的作用

例如：运铁蛋白（transferrin，Tf）受体对Tf糖链的识别

正常人血清中Tf的N-糖链主要为二天线，并不带核心Fuc，其与受体结合的Kd=4.9x10-8mol/L；而孕妇血清中较多为三或四天线，并带核心Fuc，其Kd=9.8x10-8mol/L；两者相较，亲和力后者低约50%。第99页/共175页（4）在病原体侵袭中的作用

流感病毒：病毒通过识别黏膜细胞表面糖链末端的唾液酸入侵，但是不同的型的病毒专一识别不同的类型的唾液酸。

A型B型5-乙酰神经氨酸或5-羟乙酰神经氨酸（Neu5Ac）（Neu5Gc）C型5，9-二乙酰神经氨酸（Neu5，9Ac2）流感病毒细菌：肺炎双球菌识别肺和脑膜细胞表面糖链末端的GlcNAc；而嗜腐球菌主要识别泌尿道细胞表面糖链末端的GalNAc和GlcNAc。

寄生虫：恶性虐原虫裂殖子通过识别红细胞表面血型糖蛋白A（glycophorinA）糖链末端的NeuAc，而入侵红细胞。第100页/共175页（5）在精-卵细胞识别中的作用

在受精过程中，首先由精子和卵细胞膜外称透明带的糖蛋白层结合，诱发精子的顶体反应。只有经过顶体反应的精子才能穿过透明带与卵细胞膜融合，完成受精过程。透明带糖蛋白层含3种蛋白，分别为ZP-1、ZP-2和ZP-3，前两者都带有N-糖链，但只有ZP-3含O-GalNAc糖链。精子通过其精子蛋白（SP56，分子量为5.6万）识别ZP-3分子上O-GalNAc糖链，很可能是糖链上的-Gal，而与之结合诱发顶体反应。实验证明用半乳糖氧化酶处理ZP-3后，可阻止其与精子的结合。第101页/共175页第102页/共175页第103页/共175页精子第104页/共175页Figure20-26.Schematicdrawingofhowthecorticalreactioninamouseeggisthoughttopreventadditionalspermfromenteringtheegg.ThereleasedcontentsofthecorticalgranulesbothremovecarbohydratefromZP3soitnolongercanbindtothespermplasmamembraneandpartlycleaveZP2,hardeningthezonapellucida.Togetherthesechangesprovideablocktopolyspermy第105页/共175页5、在细胞粘附中的作用

参与细胞粘附的分子绝大多数是N-糖链的糖蛋白，如：整合蛋白（integrin）、选择素（selectin）、免疫球蛋白家族和纤连蛋白（fibrinectin，Fn）等。

第106页/共175页

整合蛋白（51）是高度N-糖基化的糖蛋白，亦为Fn的受体。近期发现Fn的糖链不影响其与整合蛋白的结合；但是，整合蛋白糖链的变化却可明显影响其与Fn的结合反应。如：糖苷酶处理51后，当去除末端NeuAc、Gal和GlcNAc残基，主要是GlcNAc，其粘附活性可下降60%。原因是5和1亚基上N-糖链可促进亚基的聚合和维持特定的构象，这是两者有效结合的基础。第107页/共175页五、糖链结构与疾病（一）细胞癌变与糖链结构的改变

细胞癌变后，除常发现细胞表面Fn丢失和一些新的糖蛋白合成之外，主要表现是细胞表面糖蛋白糖链结构的变化。

1、恶性肿瘤细胞糖蛋白N-糖链结构改变的主要类型第108页/共175页恶性肿瘤细胞膜上糖蛋白N-糖链结构改变类型类型酶学机制天线数增加(1)LacNAc重复序列出现或增加(2)核心Fuc增加出现偏二天线N-糖链(3)平分型（bis-）GlcNAc增加外围链Fuc增多末端NeuAc连接键改变(4)高Man型N-寡糖链出现和增加末端NeuAc数量变化GlcNAcT（IV和V）活力增高13GlcNAcT活性增高16FucT活力增高GlcNAcT-IV活力>GlcNAcT（II）GlcNAc（III）活力升高13FucT活性增高-甘露糖苷酶I和GlcNAcT（I）活力下降第109页/共175页Man14R2Man12Man163GlcNAc1GlcNAc1Man14R

Man12Man163GlcNAc

1GlcNAc162GlcNAc1Man14R

Man1

Man163GlcNAc

1GlcNAc124GlcNAc162GlcNAc1(C2C2,6)(C2,4C2,6)(C2C2)(1)

天线数增加——是肿瘤糖蛋白常见的糖链变化。

据报道带有C2,6分支的N-糖链的三、四天线糖链与很多恶性肿瘤的转移潜力有正比关系。第110页/共175页(2)

LacNAc重复序列出现或增加——[Gal14GlcNAc14]n结构主要出现在具有C2,6分支的三、四天线N-糖链上。Man14R

Man12Man163GlcNAc

1GlcNAc162GlcNAc1Man14R

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Man163GlcNAc

1GlcNAc124GlcNAc162GlcNAc1(C2C2,6)(C2,4C2,6)[Gal14GlcNAc14]n[Gal14GlcNAc14]n第111页/共175页偏二天线N-糖链Man14RMan1GlcNAc12Man163Man14R2Man12Man163GlcNAc1GlcNAc1Man14R2Man1

Man163GlcNAc1GlcNAc124GlcNAc1GlcNAcT-IIGlcNAcT-IV正常途径Man14RMan1

Man163GlcNAc124GlcNAc1GlcNAcT-IIGlcNAcT-IV异常途径(3)