三HPLC分析方法的建立

第三讲.HPLC分析方法的建立天津市倍思乐色谱技术开发中心BaseLine®现在是1页\一共有78页\编辑于星期六一.RPC分析方法建立二.NPC分析方法建立三.GPC分析方法四.HPLC应用实例五.HPLC的定量分析现在是2页\一共有78页\编辑于星期六一.反相HPLC（RPC）分析方法的建立现在是3页\一共有78页\编辑于星期六建立分析方法的步骤样品信息分析目的要求样品制备选择检测方法和条件选择HPLC方法优化分离条件定性定量分析分析方法验证现在是4页\一共有78页\编辑于星期六样品中的化学成分化合物的结构与官能团化合物的分子量化合物的酸碱性和pKa样品适宜的溶剂及溶解度样品各成分的含量范围化合物的紫外吸收光谱样品的组成与性质现在是5页\一共有78页\编辑于星期六样品的制备溶剂萃取固相萃取膜分离，超滤，超临界萃取等现在是6页\一共有78页\编辑于星期六图1非离子样品的反相分离过程示意图黑点表示在极性流动相和非极性固定相间分配的样品分子RPC的保留机理现在是7页\一共有78页\编辑于星期六影响RPC的保留的因素：现在是8页\一共有78页\编辑于星期六1.流动相的影响：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷A+B：水+有机溶剂最佳分离条件：1<k<10现在是9页\一共有78页\编辑于星期六2.%B的选择：现在是10页\一共有78页\编辑于星期六3.流动相强度：现在是11页\一共有78页\编辑于星期六水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷现在是12页\一共有78页\编辑于星期六4.色谱柱和柱温的影响：

非极性、非离子化合物的RPC保留值规则：(弱）未键合硅胶≤氰基<C1（TMS）<C3<C4<苯基<C8≈C18（强）通常柱温增加1℃，K会减少1%-2%

现在是13页\一共有78页\编辑于星期六反相色谱的选择性：溶剂强度的选择性溶剂类型的选择性柱类型对选择性的影响温度对选择性的影响现在是14页\一共有78页\编辑于星期六1.溶剂强度的选择性

现在是15页\一共有78页\编辑于星期六2.溶剂类型的选择性

现在是16页\一共有78页\编辑于星期六现在是17页\一共有78页\编辑于星期六3.柱类型对选择性的影响

现在是18页\一共有78页\编辑于星期六4.温度对选择

性的影响：

现在是19页\一共有78页\编辑于星期六反相色谱中分析方法的建立：反相方法建立的推荐步骤：1.调整%B，使0.5<k<20，（1<k<10更好）2.检查峰拖尾或塔板数低的现象3.如果必要，调整选择性a.微调%Bb.改变有机溶剂c.混合有机溶剂d.改变柱类型e.改变温度4.优化柱条件（柱长、颗粒尺寸、流速）现在是20页\一共有78页\编辑于星期六现在是21页\一共有78页\编辑于星期六现在是22页\一共有78页\编辑于星期六混合溶剂的使用：现在是23页\一共有78页\编辑于星期六现在是24页\一共有78页\编辑于星期六柱类型的影响：现在是25页\一共有78页\编辑于星期六不同溶剂与柱类型的结合使用：现在是26页\一共有78页\编辑于星期六现在是27页\一共有78页\编辑于星期六正相色谱分析方法的建立现在是28页\一共有78页\编辑于星期六1.样品在RPC中不保留（亲水性太强）2.样品在RPC中保留太强（疏水性太强）3.采用RPC分离不能获得足够的峰间距（α=1）4.样品含有空间异构体，立体异构体或非对映异构体5.期望回收到大量疏水性样品组分（制备色谱）6.样品溶于非极性溶剂（若采用RPC柱，会对直接进样造成问题）使用正相色谱（NPC）的理由：现在是29页\一共有78页\编辑于星期六正相色谱保留机理现在是30页\一共有78页\编辑于星期六现在是31页\一共有78页\编辑于星期六现在是32页\一共有78页\编辑于星期六正相分析方法建立的推荐方法：

1.调整%B，使0.5<K<20，（氰基柱、己烷-丙醇做流动相）2.检查峰拖尾现象3.如必要，调整选择性a.微调%Bb.改变有机溶剂种类（MC、MTBE、EtAc）；微调%Bc.混合有机溶剂d.改变柱类型（二醇、氨基、硅胶）；微调%B4.优化色谱柱条件（柱长、颗粒大小、流速）现在是33页\一共有78页\编辑于星期六现在是34页\一共有78页\编辑于星期六NPC溶剂选择性实验的对应色谱图15×0.46cm硅胶柱，流动相如前，2.0ml/min，350C。样品为取代萘混合物，取代基：12-OCH3，21-NO2，31，2-（OCH3）2，41，5-（NO2）2；51-CHO，82-CHO，91-CH2CN，101-OH，111-COCH3，122-COCH3，132-OH。现在是35页\一共有78页\编辑于星期六GPC分析方法现在是36页\一共有78页\编辑于星期六SEC保留机理现在是37页\一共有78页\编辑于星期六现在是38页\一共有78页\编辑于星期六GFC:凝胶过滤色谱水相流动相分离水溶性大分子固定相：多糖型凝胶、多孔交联聚甲基丙稀酸酯类树脂、交联聚乙稀基醇树脂、羟基化聚醚类亲水性树脂等。GPC:凝胶渗透色谱有机相流动相分离脂溶性高分子固定相填料：苯乙烯-二乙烯苯多孔微球系列现在是39页\一共有78页\编辑于星期六理想SEC填料的性能要求

现在是40页\一共有78页\编辑于星期六

SEC填料的色谱特征：现在是41页\一共有78页\编辑于星期六SEC应用：分离复杂样品，然后再以高分辨率的HPLC分离纯化.分析纯化高分子化合物，以确定单聚、二聚和多聚物.以校正曲线估算大分子物质分子量.现在是42页\一共有78页\编辑于星期六现在是43页\一共有78页\编辑于星期六现在是44页\一共有78页\编辑于星期六现在是45页\一共有78页\编辑于星期六实例:凝胶渗透色谱法测定羟乙基淀粉分子量色谱条件:1.色谱仪器：pharmaciaLKBHPLCpump2248KNAUERDifferental-referactometer2.色谱柱：ShodexOHpakSB-804HQ(聚羟甲基丙烯酸酯凝胶)规格：

柱名

排阻限(Pullulan)

粒径(μm)

尺寸(mm)

SB-804

HQ

1,000,000

10

8.0

x

3003.流动相：0.7%硫酸钠+0.02%叠氮化钠4.流速：0.5ml/min5.柱温：35℃现在是46页\一共有78页\编辑于星期六实验步骤：1.选用分子量为2000000和180的两种淀粉确定该色谱柱的检测窗口,见图一。

图一：分子量为180的淀粉的色谱图tR1:19.673min分子量为2000000的淀粉的谱图tR0:12.902min现在是47页\一共有78页\编辑于星期六2.分别以分子量为11800、22800、47300、112000、212000淀粉标准品，其相应的GPC谱图，见图二。图二：分子量为11800淀粉谱图tR2：16.965分子量为22800淀粉谱图tR2：16.230分子量为47300淀粉谱图tR2：15.445分子量为112000淀粉谱图tR2：14.930分子量为2000000淀粉谱图tR2：13.720现在是48页\一共有78页\编辑于星期六3.标定曲线的确定现在是49页\一共有78页\编辑于星期六4.未知淀粉谱图

y=-2.692x+5.6637R2=0.9989X=(VR-VR1)/(VR0-VR1)tR1:19.673mintR0:12.902mintR1:14.530计算得：未知淀粉M=29046现在是50页\一共有78页\编辑于星期六银杏内酯色谱条件：色谱柱：BaselineC184.6×150mm,5μm流动相：甲醇：水：四氢呋喃=25：65：10流速：1ml/min检测：ELSD,蒸发管温度85℃，气体流速4.0Bar现在是51页\一共有78页\编辑于星期六系统评价峰号峰名保留时间/min峰面积mAUs塔板数(N)分离度(Rs)拖尾因子USPTf1银杏内酯A6.247158814.3445146.719/1.1742银杏内酯B7.615402280.1886086.1683.1611.1443白果内酯8.870418603.3446992.2792.6221.0914银杏内酯C11.713330196.2507052.8474.8990.981现在是52页\一共有78页\编辑于星期六

五种二氢吡啶类药物色谱条件：色谱柱：BaselineC184.6×250mm,5μm流动相：甲醇：水=75:25流速：1ml/min检测：UV237nm现在是53页\一共有78页\编辑于星期六系统评价峰号峰名保留时间/min峰面积mAUs塔板数(N)分离度(Rs)拖尾因子USPTf1杂质12.74567928.125/1.8181/2硝苯地平4.927294767.2507041.1491.4751.4153尼群地平8.078648196.7508204.8964.0431.2834尼莫地平9.060810590.8758377.0292.2371.2605非洛地平14.5971114624.25010027.2095.3661.2556拉西地平25.787691817.81310525.8752.9571.229现在是54页\一共有78页\编辑于星期六酚咖片色谱条件：色谱柱：BaselineC18,4.6×250mm,5μm流动相：甲醇：水：冰醋酸=32：65：3流速：1ml/min检测：UV275nm现在是55页\一共有78页\编辑于星期六酚咖片色谱图（d/qhq/酚咖片/B0029,5.0μl）系统评价峰号峰名保留时间/min峰面积MAUs塔板数(N)分离度(Rs)拖尾因子USPTf1扑热息痛3.812285765.188///2咖啡因6.008183115.5476073.3806.2261.4383阿司匹林14.447180600.40612993.96617.5691.2174苯甲酸20.563475402.96916084.1758.9951.172现在是56页\一共有78页\编辑于星期六现在是57页\一共有78页\编辑于星期六现在是58页\一共有78页\编辑于星期六现在是59页\一共有78页\编辑于星期六现在是60页\一共有78页\编辑于星期六现在是61页\一共有78页\编辑于星期六现在是62页\一共有78页\编辑于星期六五.HPLC定量分析方法现在是63页\一共有78页\编辑于星期六

1.归一化法：以峰面积为基础的归一化法加校正因子的归一化法2.外标法：外标曲线法外标一点法3.内标法：内标曲线法内标一点法内标加校正因子法4.标准加入法现在是64页\一共有78页\编辑于星期六1.归一化法：1.1以峰面积为基础的归一化法1.2加校正因子的归一化法

相对校正因子：现在是65页\一共有78页\编辑于星期六2.外标法

2.1外标曲线法现在是66页\一共有78页\编辑于星期六2.2外标一点法：现在是67页\一共有78页\编辑于星期六现在是68页\一共有78页\编辑于星期六现在是69页\一共有78页\编辑于星期六内标法现在是70页\一共有78页\编辑于星期六3.1内标曲线法现在是71页\一共有78页\编辑于星期六3.2内标一点法：现在是72页\一共有78页\编辑于星期六3.3内标加校正因子法：相对校正因子：现在是73页\一共有78页\编辑于星期六例2校正因子法的测定复方炔诺酮片中炔诺酮的含量ODS色谱柱、甲醇－水（60：40）流动相、监测器UV280nm、对硝基甲苯为内标物。（1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物）、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成10ml容量，进样10ul，记录色谱图。重复3次。测得含0.0733ml/ml内标物、0.600mg/ml炔诺酮和0.03