WB过程中常见问题及处理方法_第1页
WB过程中常见问题及处理方法_第2页
WB过程中常见问题及处理方法_第3页
WB过程中常见问题及处理方法_第4页
WB过程中常见问题及处理方法_第5页
已阅读5页,还剩26页未读 继续免费阅读

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

(优选)WB过程中常见问题及处理方法现在是1页\一共有31页\编辑于星期一

基本原理通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色,分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。现在是2页\一共有31页\编辑于星期一

应用1.目的蛋白的表达特性分析2.目的蛋白与其它蛋白的互作3.目的蛋白的组织定位4.目的蛋白的表达量分析现在是3页\一共有31页\编辑于星期一现在是4页\一共有31页\编辑于星期一现在是5页\一共有31页\编辑于星期一现在是6页\一共有31页\编辑于星期一三、WB的影响因素步骤较多,任何一步都可能影响结果1、电泳分离蛋白蛋白抽提;蛋白定量;样品制备变性;上样量;电泳(电压、电流的大小,胶浓度、制胶)现在是7页\一共有31页\编辑于星期一2、转膜膜的选择;膜的确认;特殊处理;……现在是8页\一共有31页\编辑于星期一3、封闭封闭液的选择;封闭条件优化;……现在是9页\一共有31页\编辑于星期一4、漂洗漂洗液的配制与选择漂洗时间及次数现在是10页\一共有31页\编辑于星期一5、抗体孵育抗体及稀释液选择;抗体稀释倍数优化;抗体孵育时间;……现在是11页\一共有31页\编辑于星期一6、曝光曝光时间的掌控现在是12页\一共有31页\编辑于星期一四、注意事项1.蛋白样品的提取尽可能新鲜组织或蛋白避免反复冻融对于有些蛋白,加去磷酸化的(NaF)尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子(通过加入核酸酶或采取不同提取策略)

选择合适的裂解液准确定量(BSA标准蛋白)

现在是13页\一共有31页\编辑于星期一现在是14页\一共有31页\编辑于星期一2、制胶根据不同的蛋白大小,选择不同的浓度制胶。现在是15页\一共有31页\编辑于星期一制胶的时候一定要注意玻璃板一定要干净,不能有残留的胶。玻璃板底部放平,尽量不能漏胶灌胶的时候,不能太快,容易产生旋窝水或异丙醇压的时候,不能太久现在是16页\一共有31页\编辑于星期一

3、转膜a泡膜:转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移液浸泡20min;

凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡,就会在转膜过程中出现凝胶皱缩,导致出现转移条带变形bPVDF膜具有疏水性,需用甲醇浸泡,活化现在是17页\一共有31页\编辑于星期一c膜顺序:阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板,不能放反d转膜过程产生大量的热,注意冷却e具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定;目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,反之则短f避免直接用手碰杂交膜,使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。现在是18页\一共有31页\编辑于星期一g夹好膜和凝胶后,确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在,否则会导致转膜不完全h保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样,过大和过小都会影响转膜效率i一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景现在是19页\一共有31页\编辑于星期一4、封闭a脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素b如果封闭剂中含磷酸酶,用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响,因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化c检测磷酸化抗体时,不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂现在是20页\一共有31页\编辑于星期一5、孵育a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净,有利于降低背景;b注意一抗二抗的匹配c一抗二抗的效价问题现在是21页\一共有31页\编辑于星期一五、常见问题及解决电泳中的问题︶条带呈笑脸状——凝胶不均匀冷却,中间冷却不好;——电泳系统温度偏高现在是22页\一共有31页\编辑于星期一︵条带呈皱眉状

可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全现在是23页\一共有31页\编辑于星期一拖尾样品溶解不好现在是24页\一共有31页\编辑于星期一纹理(纵向条纹)样品中含有不溶性颗粒现在是25页\一共有31页\编辑于星期一条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜现在是26页\一共有31页\编辑于星期一条带两边扩散加样量过多现在是27页\一共有31页\编辑于星期一

Westernblot结果曝光问题

背景过高且不均匀1、封闭不充分——延长封闭时间;——更换合适的封闭剂(脱脂奶粉,BSA,血清等)2、一抗浓度过高——增加一抗稀释倍数;3、抗体孵育温度过高——4℃孵育现在是28页\一共有31页\编辑于星期一4、二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应——设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度5、洗膜不充分——增加洗涤次数,增加洗膜次数现在是29页\一共有31页\编辑于星期一没有阳性条带或很弱1、一抗、二抗等不匹配订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论