发酵工程综述

发酵工程综述娄宏跃（12级生物工程专业（1）班）摘要：抗体酶是具有催化活性的免疫球蛋白，又被称为催化抗体。[1]由于它兼具抗体的高度选择性和酶的高效催化性，因而催化抗体制备技术的开发预示着可以人为生产适应各种用途的，特别是自然界不存在的高效催化剂，对生物学、化学和医学等多种学科有重要的理论意义和实用价值。本文重要对抗体酶的生产工艺及其应用进行综述。关键词：抗体酶；发酵；微生物；酶工程前言：自从1986年Schultz和Lerner初次证实由过渡态类似物为半抗原,通过杂交瘤技术产生的抗体具有类似酶的催化活性以来,抗体酶一直是科学界的“宠儿”。[2]短短十几年,抗体酶已显示出在许多领域的潜在应用价值,涉及许多困难和能量不利的有机合成反映,前药设计,临床治疗,材料科学等多个方面。抗体酶和天然酶在功能上有许多相似之处,如催化效率高,具有专一性、区域和立体选择性,可进行化学修饰和具有辅助因子等,并且在饱和动力学与竞争性克制方面也极其相似。一、抗体酶的发现1946年，Pauling用过渡态理论阐明了酶催化的实质，即酶之所以具有催化活力是由于它能特异性结合并稳定化学反映的过渡态(底物激态)，从而减少反映能级。他指出，酶通过某种方式与高能、短寿命的过渡态结合而起催化作用。这个过渡态构型中某些键在形成，另一些键在断裂，存在时间极短，半衰期约为10~10s，实际中很难捕获。[3]同时，Pauling又指出酶和抗体的主线不同在于前者选择性的结合一个化学反映的过渡态，而抗体则是结合一个基态分子。既然过渡态分子难以捕获，而过渡态类似物是可以模拟一个酶催化反映过渡态的结构的稳定物质，于是人们就设想，只要寻找到与反映中决定性环节的相应酶紧密结合的酶竞争性克制剂，就等于发现了过渡态类似物；尚有一种思绪，就是这种类似物也能根据化学反映机制推测设计出来。然后，以过渡态类似物为半抗原，运用哺乳动物的免疫系统，诱导与其互补构象的抗体产生，这种抗体即具有催化活性——这就是1969年Jencks提出的，他发展了Pauling的理论；接着，Kohler和Milstein于1975年发明了具有历史意义的单克隆技术，使抗体酶的生产成为也许。[4]Lerner和P．C．Schultz分别领导各自的研究小组独立地证明了：针对羧酸酯水解的过渡态类似物产生的抗体，能催化相应的羧酸酯和碳酸酯的水解反映。1986年美国《Science》杂志同时发表了他们的发现，并将这类具有催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体。抗体有极高的亲和力，解离常数在10~10mol/L，这与酶相似，但无催化活力。酶的催化机制在于它能结合底物产生过渡态，减少能垒，改变化学反映的速度。抗体酶同时具有了抗体和酶的特性，应用前景十分广阔。[5]抗体酶的应用(一)在有机化学领域的应用[5]目前，已成功筛选出可催化6种类型酶促反映和几十种化学反映的抗体酶，可催化许多困难和能量不利的反映．催化类型涉及底物异构化反映、酯水解、酰胺水解、酰基转移、Claisen重排反映、光诱导反映、氧化还原、金属螯合、环化反映等，抗体酶还可以作为手性助剂控制光加成反映产物的立体化学，用于手性化合物的拆分，还可用于探索化学反映机制．(二)在医学领域的应用[7]运用抗体酶催化药物在体内的还原，有助于机体对药物的吸取，并减少药品的毒副作用；将抗体酶技术和蛋白质融合技术结合在一起，设计出既有催化功能又有组织特异性的嵌合抗体，用于切割恶性肿瘤；[7]将抗体酶直接作为药物，以治疗酶缺陷症患者。(三)在戒毒领域的应用[8]抗体酶可以拮抗可卡因等麻醉剂的成瘾性，使可卡因失去刺激功能，以帮助瘾君子戒除毒瘾．抗体酶还可以水解清除血液中的毒素，如分解可卡因、有机磷毒剂等．三、抗体酶的产生途径和方法(一)直接引入天然或合成的催化基团[9]直接引入天然或合成的催化基团有两种方法，分别是化学诱变法和蛋白质工程技术，化学诱变法是将合成或天然具有催化活性的基团通过化学修饰法引人到抗体分子中。蛋白质工程技术则是通过蛋白质工程技术使抗体结合部位的氨基酸残基产生定向改变，既可直接产生酶活性，也可对初步具有酶活性的抗体进行进一步改造，构建高活性抗体。(二)基因工程技术由免疫学可知，对独特的分子抗原，动物可有5～1万个不同的B细胞产生抗体，而通过细胞融合产生的单克隆抗体一般只有上百个。因此，重组抗体分子在细菌E．coli中的表达，可提供抗体库。基因工程抗体库得到的抗体数量比免疫技术得到的抗体要高几个数量级，但该方法中筛选抗体的技术还需进一步完善。四、菌种选育及培养基的制备[10](一)常见菌种所有的微生物在一定条件下都能合成多种多样的酶。但并不是所有的都可以用于酶的生产。一般来说，酶的生产的细胞必须具有的条件是：产量高、容易培养和管理、产酶稳定性好、利于酶的分离纯化、安全可靠、无毒性。大肠杆菌大肠杆菌可以用于生产多种酶，其生产的酶属于胞内酶，需要通过细胞破碎才干分离得到。枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物，生产的蛋白酶为胞外酶，而碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。霉菌霉菌有曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉、链霉等，其中，可用于生产蛋白酶的有根霉、毛霉、红曲霉、链霉，它们通过诱导或改造后，给予一定条件下可用于生产抗体酶。(二)培养基碳源大多数产酶微生物采用淀粉或其水解产物，如糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖等为碳源。氮源氮源可分为两大类，有机氮和无机氮两大类，有机氮是各类蛋白质及其水解产物，如酪蛋白、豆饼粉、花生冰粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、蛋白水解液、氨基酸等，无机蛋白是各种含氮的无机化合物，如氨水、硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等铵盐和硝酸盐。无机盐无机盐可分为两大类，分别为大量元素和微量元素，大量元素有：磷、硫、钾、钙、钠、镁、氯等。微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴等。五、生产工艺流程保藏细菌保藏细菌细胞活化细胞活化固定化细胞原生质体细胞扩大培养固定化细胞原生质体细胞扩大培养预培养固定化原生质体发酵预培养固定化原生质体发酵无菌空气培养基分离纯化无菌空气培养基分离纯化酶酶六、发酵工艺控制研究[11](一)PH值的调节控制(二)温度的调节控制(三)溶解氧的调节控制(四)泡沫的控制和消除产品的分离与提纯(一)细胞的破碎当生产的抗体酶为胞内酶时，则要用细胞破碎的方法，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法、酶促破碎法。(二)酶的提取用适当溶剂解决含酶原料，使酶充足溶解到溶剂中。为了提高酶的稳定性，以免引起酶的变性失活可适当加入某些保护剂，如酶作用的底物、辅酶、某些抗氧化剂等。(三)沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶在溶液中溶解度低，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质分离的技术过程。该方法有多种，如盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶质沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等。(四)离心分离借助离心机旋转所产生的离心力，使大小、密度不同的物质分离出来。根据分离物质的特性，应选择适当的离心机、离心方法和离心条件。总结目前，抗体酶研制和应用的许多历程还不清楚，从而无法设计过渡态稳定类似物。而在反映历程中，抗体酶的方法又将在其中发挥重要作用，可以通过构制预期的抗体酶来验证反映历程，使理论上的历程更接近实际。参考文献[1]陈龙等.抗体酶简介[J].生物学通报,1996,04.[2]PaulingL.Nature,1948,161:701.[3]石颖,许根俊,鲁子贤等.抗体酶[J].生物化学与生物物理进展,1990,03.[4]冯雁,杨同书等.抗体酶研究的新进展[J].生物学杂志,1997,04.[5]刘寅曾,诸季瑜.催化性抗体.化学进展,1990,2:117[6]ShelherdTA,JungheimLN,MeyerDLetal.ANovelTargtedDeiverySystemUtilizingaCephalosporinoncolyticProdrugActivatedbyanAntibodyB2LactamaseConjugatefortheTreatmentofCancer.BioorganicMedicinalChemistryLetter,1991,1:21[7]郭勇等.酶工程.科学出版社,2023,8(2).[8]LandryDW,ZhaoK,YangGXQetal.Antibody2CatalyzedDegrad