ELISA产品简析与探讨

ELISA产品简析与探讨公司技术服务中心2011.08现在是1页\一共有28页\编辑于星期日一.ELISA的发展背景与原理简析什么是ELISA？ELISA——酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）发展历程和应用？起源于20世纪60年代：EIH（酶免组织化学技术，1966）→EIA（酶免疫测定，1971）→McAb技术（单克隆抗体，1975）→基于ELISA技术的快速检测产品（传染病，妊娠诊断，植物疫病，农兽残等）农兽残小分子药物ELISA检测试剂盒技术原理？

直接竞争法：“抢凳子”理论现在是2页\一共有28页\编辑于星期日二.术语抗体？为何能测定小分子？抗体（Antibody），又称免疫球蛋白（Immunoglobin，Ig），是一种免疫系统中鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质。仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。（“钥匙与锁的关系”）以克伦特罗试剂盒为例：包被板：包被有以半抗原（克伦特罗）经过偶联后免疫所获得的多克隆抗体；该抗体可以识别克伦特罗或者其类似物Anti-cle抗体：通过共价结合或非公价吸附到微孔板达到固相化目的（Coatingtechniques）现在是3页\一共有28页\编辑于星期日单克隆抗体技术和多克隆抗体技术比较分析：

特别说明：不同的技术平台上应用的原料虽然名称一致（比如克伦特罗的酶标和金标抗原抗体原料），但抗体的来源属性可能是不一样的。某抗体适合做酶标产品，但是可能不适合做金标产品。单抗技术特征

名称单克隆抗体monoclonalantibody

多克隆抗体polyclonalantibody产生1种抗原决定簇+1个效应B细胞→杂交瘤（增殖+分泌特异性抗体）多种抗原决定簇+效应B细胞或同一种抗原决定簇+不同的效应B细胞特征及优点高特异性、高均一性；批间CV小；广泛应用ELISA、WB、IP、IF、ICC、IHC（抗体的用量比较大或者需要长期使用一致的抗体）制备时间短、首次制备成本低，特异性和灵敏度取决于制备技术；识别多个抗原表位（不会影响实验结果）；利用ELISA法可以检测类似物缺陷不能进行沉淀和凝集反应；反应强度不如多克隆抗体；制备技术复杂而且费时费工；无法进行多合一检测；（对于某些药物的代谢物检测上可能存在假阴性）批间CV大；交叉反应率高（特异性不强）现在是4页\一共有28页\编辑于星期日检测（下）限和灵敏度试剂盒灵敏度：试剂盒本身的灵敏度和对某一具体样本的检测限是不一样的。试剂盒本身的灵敏度一般是指试剂盒标准品中除零标准外浓度最小的标准品浓度值。其理论定义为：测定10孔B0吸光度值，算出平均值X和标准偏差（SD），计算出3倍SD值，据公式X+3SD（X+3SD）得出的结果即为试剂盒灵敏度（一般招投标资料上要求的灵敏度即指标准曲线浓度最小值）针对样本的检测（下）限：其理论定义为：按照合理的前处理方法对20个阴性样本进行测定，算出平均检测值X和标准偏差（SD），计算出3倍SD值，据公式X+3SD得出的结果即为该样本的检测（下）限。

现在是5页\一共有28页\编辑于星期日注：文件引自农业部备案文件2010现在是6页\一共有28页\编辑于星期日

杭州迪恩克伦特罗EIAIC50半对数曲线Cubicspline拟合中监所备案采用试剂盒灵敏度和检测（下）限与曲线的关系：1.IC50是什么？以竞争法为例：～系指在酶免反应中药物产生50%抑制率时所对应的药物（标准品）浓度.2.灵敏度怎么表示比较好？用IC50值表示（使用标准曲线浓度最低点表示缺少统一标准且混乱）3.灵敏度和检测(下)限的关系?一般地，灵敏度越高，检测限也就越高。在设定判断阈值（判断阴性阳性值）时，阈值应可能落在曲线斜率较大处（即形状较陡处；靠近IC50值）招标资料上的所谓灵敏度现在是7页\一共有28页\编辑于星期日

相关系数（对数曲线）

半对数曲线，线性拟合大多数EXCEL软件就是使用该曲线算法相关系数变异系数（CV）：体现试剂盒的稳定性和准确性。CV=SD/X※100%）相关系数（Correlation

coefficient）:在概率论和统计学中称相关系数或关联系数。显示两个随机变量之间线性关系的强度和方向

。试剂盒备案要求：

C.C≥0.9920曲线拟合方式：1.线性方程2.四参数3.Cubicspline现在是8页\一共有28页\编辑于星期日特异性（交叉反应率）药物的交叉反应率：定义：引起50%抑制的标准物浓度与类似物引起50%抑制的浓度值之比。

比如客户问：克伦特罗试剂盒/检测卡对莱克多巴胺有没有交叉（能不能测）?计算公式：～=IC50CL/IC50Rac※100%意义：类似物的交叉反应率参数体现试剂盒特异性。物质名称交叉反应率（％）Ractopamine100.0(1R,3R)-ractopamine489.0RactopamineglucuronideC384.0(1S,3R)-ractopamine134.0Dobutamine5.3Ritodrine3.6RactopamineglucuronideB3.1(1S,3S)-ractopamine1.9RactopamineglucuronideA1.0(1R,3S)-ractopamine0.9Bamethane0.3Isoxsuprine0.2Salmeterol0.2Fenoterol0.1Clenbuterol<0.01Salbutamol<0.01现在是9页\一共有28页\编辑于星期日试剂盒检测限：1.检测限的意义：对某一具体药物和具体样本来说，并非试剂盒的灵敏度越高越好，理想的状态是检测范围的中间值与该药物在某一样本的“超标值”或“阳性值”接近，既可以减少误差又方便客户使用（即阈值和IC50接近）2.样本差异性：结合样品前处理的实际情况，由于方法局限或者杂质因素干扰时需具体分析。比如，某一试剂盒本身最低检测限为0.05ppb,而对尿样的检测限可能是0.15ppb,牛奶为0.15ppb,虾产品为0.25ppb,饲料为15ppb。3.方法差异性：不同方法检测限也可能不一样（方法检出限），不同厂家的试剂盒检测限也可能不一样。以克伦特罗试剂盒为例：现在是10页\一共有28页\编辑于星期日假阳性：

非目标成分在酶联吸附体系中的的总和。假阴性：在方法符合实际的情况下，对目标成分未产生响应或者响应不明显。试剂盒可以允许一定程度的假阳性，但是不允许假阴性的存在。举例：双汇集团技术中心质控标准要求：克伦特罗ELISA试剂盒：假阴性率0%

假阳性率0%克伦特罗金标试纸条：假阴性率0%

假阳性率3%补充资料《如何区分瘦肉精检测卡好坏》:/newsinfo.asp?id=54&newsort=2一般性招投标资料对假阳性假阴性的要求现在是11页\一共有28页\编辑于星期日三.不同反应原理ELISA试剂盒的特点比较直接竞争法试剂盒特点：1.原理简单：抗原抗体反应一步法，时间短；2.试剂构成简单；3个核心组分（见右图）显色剂采用国外最新技术，代替国内的A/B液，同时提高对HRP的灵敏度和稳定性；3.加样步骤少且加样模式较统一，操作简单且：50ul样本+100ul酶标物+100ul显色剂+100ul终止液；4.采用高灵敏度，高亲和力的抗体，决定检测分析时间短；20分钟；且采用进口的高吸附力的聚苯乙烯微孔材料固相化抗体，提高试剂盒稳定性，确保检测分析准确。5.间接竞争法试剂盒特点：1.原理相对直接竞争法要复杂，二步法；反应时间长，但可以变换为一步法反应2.试剂构成成分多：5个核心组分3.加样步骤多，试剂盒组分多，易出错，反应时间较长（一般至少50分钟）4.显色剂：国产试剂盒基本均采用A/B液，增加了加样量和试剂的复杂度抗体包被板显色剂（二合一）酶标抗原冻干粉抗原包被板酶标二抗显色剂（A液,B液）抗体工作液直接法间接法杭州迪恩北京勤邦现在是12页\一共有28页\编辑于星期日试剂盒操作图解酶标抗原标准品/样品①加入标准品/样品和酶标物②温育③洗板④显色⑤终止显色剂⑥读数现在是13页\一共有28页\编辑于星期日直接竞争法试剂盒比较？抗体包被板：进口高吸附力聚苯乙烯材料，抗体固相化更稳定，采用高灵敏度多抗，确保试剂盒灵敏度酶标物冻干粉技术：确保酶标物在运输中和保存中的稳定性，即溶即用型反应时间：“10分钟+10分钟”模式混合显色剂：对HRP响应快，二合一，使试剂盒操作更方便，但瓶子的材质会影响其稳定性加样模式的统一化：50ul样本+100ul酶标物+100ul显色剂+100ul终止液联机软件：数据处理联机化，按“start”键既出分析报告抗体包被板显色剂（二合一）酶标抗原冻干粉抗体包被板酶标抗原（浓缩液）显色剂（A液，B液）直接法直接法显色剂（TMBwitharedindicator）直接法酶标物浓缩液抗体包被板杭州迪恩德国拜发华安麦科现在是14页\一共有28页\编辑于星期日直接竞争法试剂盒的稳定性优势决定稳定性的关键组分优势：采用进口的高吸附力的聚苯乙烯微孔包被多克隆抗体：固相化效果和稳定性要胜于一般单抗、包被抗原和国产的低吸附微孔板系列酶标物：采用冻干粉形式，直接消除酶标物在运输中的不利因素，溶解之后在2～8度仍然稳定。显色剂（含有特殊的稳定剂确保显色剂不变质）《关于加强兽药残留检测试剂(盒)管理的通知》(农办医[2005]3号)现在是15页\一共有28页\编辑于星期日直接竞争法试剂盒的稳定性上应注意事项1.存储与使用：储存：低温2-8℃，忌冷冻。未使用完的试剂盒注意拉紧铝箔袋封口以避免板条受潮失效使用：回温后于室温25±2℃环境下使用反应：反应中避免阳光直射、空调或风扇直吹。2.标准操作（包括前处理）：熟读产品说明书现在是16页\一共有28页\编辑于星期日四.药物代谢动力学简述样品尿液肌肉肝脏眼球含量10~80ng/ml6.1ng/g39ng/g118ng/g与血浆的比例40倍3~15倍20~90倍107倍资料引自：吕燕，鲍伟华，余晓华，等.GC—MS法研究猪体内克仑特罗的残留消除规律[J]．中国兽药杂志，2009，43(11)26-29现在是17页\一共有28页\编辑于星期日另例：莱克多巴胺的药代学规律莱克多巴胺作为瘦肉精的替代品，滥用趋势明显上升。在莱克多巴胺的检测中，常常会遇到这样的现象：用ELISA检测阳性的样品，用色谱法确证时却都为阴性，而且检测结果大相径庭。不同ELISA试剂盒的检测结果也相差很大。1.莱克多巴胺的快速代谢特性

莱克多巴胺在动物体内不能稳定存在，会快速代谢，国外资料表明，在停药3天后，动物体内的莱克多巴胺原药残留量将很低，而以代谢物的形式存在动物体内。莱克多巴胺的代谢物主要有三种：莱克多巴胺葡萄糖甘酸A、莱克多巴胺葡萄糖甘酸B、莱克多巴胺葡萄糖甘酸C，而三种代谢物的比例是不确定的。举例说明：如果给一头猪喂添加莱克多巴胺的饲料，在停药第0天尿样中的莱克多巴胺残留浓度为20ppb，第3天后，莱克多巴胺残留浓度将<1ppb，而莱克多巴胺葡萄糖甘酸A+莱克多巴胺葡萄糖甘酸B+莱克多巴胺葡萄糖甘酸C的浓度将>19ppb。2.莱克多巴胺的正确检测方法根据上述，要准确检测莱克多巴胺的残留量有两个选择：

A：除检测莱克多巴胺外，增加对莱克多巴胺代谢物的检测。

B：在检测前，用酶解的方法将莱克多巴胺代谢物还原成莱克多巴胺原药，再检测莱克多巴胺的含量。但酶解需要16小时。

对于ELISA试剂盒，选择A和B都是可能的，但选择A依赖于ELISA试剂盒的交叉反应特性；对于色谱方法，由于主要代谢物有三种之多，选择B更可行和方便。

部分资料引自：强致懿；《猪肝脏、肌肉、尿液和血液中莱克多巴胺残留检测方法及残留消除的研究》；文章链接：/Thesis_Y1107477.aspx现在是18页\一共有28页\编辑于星期日五.样本前处理浅析

前处理方法目的：

①测定前排除干扰组分；

②对样品进行浓缩。

原则：

①消除干扰因素；

②完整保留被测组分；

③使被测组分浓缩；方法是怎么建立的？有什么依据？分析药物的化学性质→相似相溶原理→分析样本的性质和药残的分布规律→合理的提取和除杂方法→匹配试剂盒体系（结合灵敏度和检测限）说明书上的方法是不是固定不变的？基本原则不变，可以微调和优化不同样本的前处理方法是不是可以一样?样本差异显著的情况下，不同类型样本由于引起的干扰不同，在方法设计上存在区别克伦特罗现在是19页\一共有28页\编辑于星期日前处理方法（sampletreatment）

方法的选择性问题：在动物组织多残留检测方法研究中，生物样品成分复杂，怎样达到消除非目标成分的干扰且尽可能的完整保留被测组分；则最关键的一环取决于前处理。前处理决定着方法的灵敏度和分离度，在整个试验过程中占据着90%甚至更多的工作量。样品前处理一般分为提取、净化、浓缩和衍生化4个部分方法的建立思路：分析兽残分子的理化性质和残留规律根据相似相溶和2个原则：①消除干扰因素②完整保留被测组分（对于ELISA试剂盒还需考虑前处理中带入的组分与试剂盒缓冲液的匹配度）；限制前处理中引入的假阳性或假阴性因素合理的方法回收率和添加回收率合理的空白干扰结果分析注：关于过柱和不过柱，吹干和不吹干（一步法提取）的区别点：过柱：好处：将前处理中可能会给检测结果带来负面影响的干扰因素去掉：比如在样本色素含量很高时通过过C18柱就可以有效的提高样本的回收率和降低本底干扰；缺陷：增加了前处理工作的操作步骤；

氮吹浓缩：通过相似相容原理将样本中的目标物转移和富集，目的是提高回收率和控制方法检测限。在采用一步法提取时本底干扰一般比较难以控制，只适合作为低检测限的适用方法。现在是20页\一共有28页\编辑于星期日稀释倍数和回收率

依据相似相溶的原理进行分析对于组织类样本考虑样本的实际含水量：70%当成100%并入计算。以克伦特罗试剂盒检测香肠样本为例计算稀释倍数：回收率：回收率∈[50%，120%]；CV≤20%1、定义：是在空白基质中加入一定浓度的药物，通过样本前处理方法处理过后，检测到药物浓度占实际添加浓度的比例。生物样本回收率一般介于60～120%；组织样本一般介于50%～120%2、公式：回收率=（添加管浓度-空白管浓度）/实际添加浓度*100%3、浓度单位换算：ppm=ug/ml=

ug/g；ppb=ng/ml=ng/g；ppt

=

pg/ml

=

pg/g；1ppm=1000ppb=1000000ppt举例Cap添加回收流程：1、选择已知阴性样本作空白基质。（称取2管同一个阴性样本）2、了解前处理方法。（需称取3g样本、样本稀释倍数为1倍）3、了解曲线，确定每克的添加浓度范围。（曲线浓度：0ppb、0.025ppb、0.05ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.6ppb）添加浓度最好选择在第三点到第四点之间，但必须大于检测下限和控制在曲线有效浓度范围内）现在是21页\一共有28页\编辑于星期日试剂盒的售后工作（相应问题和关键步骤分析）1.回收率偏低或偏高的原因？方法回收率低+操作+背景信号干扰（合理范围：60～120%）2.怎样加标？加哪些浓度？

加标浓度取决于：试剂盒对某样本的检测限+试剂盒灵敏度+方法+操作SOP+MRLs（最大残留限量）3.检测结果的分析：Cubicspline拟合计算中会看IC50值+相关系数）+会操作联机软件+会看检测结果4.以及对于可疑样本的处理：以莱克多巴胺试剂盒检测香肠熟食为例：设给定的判断阈值是0.5ppb，A001样本检测值为0.894ppb,要求对该样本进行复核。

复核程序：试剂盒复核（阳性样本质控）阳性阴性色谱仪器复核出检测报告出检测报告可疑样本现在是22页\一共有28页\编辑于星期日色谱质谱分析检测方法简介色谱法（Chromatography）

色谱法起源于20世纪初，1950年代之后飞速发展。原理：利用待分离的各种物质在两相中（固定相和流动相）的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离；将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。分类：根据流动相的不同，色谱技术可以分为液相色谱和气相色谱。色谱法常见的方法有：柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)等。检测器原理：热导系数氢火焰离子化电负性物质捕获电子的能力离子荷质比（离子源+加速电场+速度色散质谱图）注：HPLC-MS/MS：HPLC-MS是高效液相色谱与质谱的联用；/MS代表二级质谱，是将经过第一次质谱检测的离子以某种方式碎裂后再进行质谱检测。色谱原理国内外生化分析仪器公司现在是23页\一共有28页\编辑于星期日Agilen