chap基因操作常规技术

第四章基因工程的常规技术❖分离检测❖分子杂交❖PCR技术

❖DNA测序

❖基因定点突变

❖DNA与Pr互作现在是1页\一共有120页\编辑于星期日4.1核酸的分离与检测gDNA的分离质粒DNARNA的分离现在是2页\一共有120页\编辑于星期日细胞破碎去蛋白DNA沉淀4.1.1gDNA的提取SDS法酚抽提法CTAB法现在是3页\一共有120页\编辑于星期日CTAB法高盐:溶解低盐:沉淀蛋白、多糖分离NaAc-70%alc现在是4页\一共有120页\编辑于星期日如何保持CS-DNA的完整性?物理降解内源DNase＞pH7现在是5页\一共有120页\编辑于星期日4.1.2质粒DNA的分离纯化拓扑学的差异gDNA大,易解旋质粒小,ccc状态现在是6页\一共有120页\编辑于星期日proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs1.CsCl密度梯度超离心密度梯度沉降=扩散浮力密度差样品+EB样品BD=该位置上的CsCl密度位置分布:沉降速度、MW及离心时间现在是7页\一共有120页\编辑于星期日SolI;II;IIIcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA2.碱变性法pH12:变性程度pH7:复性速度离心:收集?现在是8页\一共有120页\编辑于星期日3.沸水浴法加酶破壁沸水浴40s离心Eth沉淀

现在是9页\一共有120页\编辑于星期日4.1.3RNA的提取原理酚-异硫氰酸胍现在是10页\一共有120页\编辑于星期日防止RNA降解的措施DEPC处理RNasin专用无菌台器皿、手套、口罩低温操作现在是11页\一共有120页\编辑于星期日4.1.4核酸质量检测紫外光谱法凝胶电泳法[ssDNA]=33(A260A310)

稀释[dsDNA]=50(A260A310)

稀释[ssRNA]=40(A260A310)

稀释荧光分析法二苯胺显色现在是12页\一共有120页\编辑于星期日分子筛;电荷效应UV→EB→荧光凝胶电泳技术现在是13页\一共有120页\编辑于星期日现在是14页\一共有120页\编辑于星期日凝胶成像系统现在是15页\一共有120页\编辑于星期日Rf、分辨力的影响因素大小,构型gel浓度电压、时间buffer凝胶浓度片段大小/kb0.35600.61100.70.8201.00.581.20.40.12现在是16页\一共有120页\编辑于星期日缓冲液及其pHTBE:缓冲力大❖长:TAE﹥TBE❖短:TAE分辨力低如何防止pH和离子强度改变?现在是17页\一共有120页\编辑于星期日RNA的检测A260变性胶28S→4.5kb18S→2.1kb现在是18页\一共有120页\编辑于星期日PAGE尿素buffer:0.51TBE同位素或荧光标记测序、多态性分析现在是19页\一共有120页\编辑于星期日＞40kb:Rf与分子大小无关交替改变的电场,线团→束状脉冲场凝胶电泳改变形状所需时间不同胶孔中摩擦力不同A-+AB-+B现在是20页\一共有120页\编辑于星期日B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图现在是21页\一共有120页\编辑于星期日现在是22页\一共有120页\编辑于星期日A-+AB-+B垂直交变电场系统场翻转系统箝位匀强电场系统旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+现在是23页\一共有120页\编辑于星期日影响分辨率的因素脉冲时间(0.1s-1000s):长脉冲,大片段电压:场强↑,最大片段范围↑电场夹角:110–120温度:4℃

现在是24页\一共有120页\编辑于星期日4.2分子杂交技术SouthernblotNorthernblotWesternblotdotblotFISH菌落原位杂交现在是25页\一共有120页\编辑于星期日4.2.1

探针与探针标记寡核苷酸片段ssords足够长度不含互补区现在是26页\一共有120页\编辑于星期日5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

Mg2+5dNTP5pppdA(-32P-dATP)5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

DNaseIDNApolI1.探针的标记现在是27页\一共有120页\编辑于星期日随机引物标记现在是28页\一共有120页\编辑于星期日5末端标记5

HOOH3

OH5

T4-PNKMg2+

pppATP

(-32P-dATP)5pp5

3

HO3

HOOH3

现在是29页\一共有120页\编辑于星期日2.

标记物及其检测标记物及性质标记方法杂交体检测法地高辛:DIGRPL酶标抗体-底物显色生物素:Bio-16-dUTPNT,TL,PCR酶标亲合素显色荧光素:罗丹明,FITC合成法荧光显微镜放射性标记非放射性现在是30页\一共有120页\编辑于星期日地高辛系统标记dUTP-连接臂-甾醇半抗原DIG抗体-显色酶交联复合物现在是31页\一共有120页\编辑于星期日现在是32页\一共有120页\编辑于星期日生物素标记GCTTGAGCAGTAACCTG显色酶Biotin

Avidin

烷烃连接臂生色底物颜色产物现在是33页\一共有120页\编辑于星期日现在是34页\一共有120页\编辑于星期日荧光素标记GCTTGAGCAGTAACCTG荧光素Biotin

Avidin烷烃连接臂现在是35页\一共有120页\编辑于星期日现在是36页\一共有120页\编辑于星期日4.2.2

Southern杂交质粒鉴定、基因位置、分子诊断酶切和电泳法可以吗?现在是37页\一共有120页\编辑于星期日现在是38页\一共有120页\编辑于星期日4.2.3Northern杂交样品,电泳,探针❖不宜碱变性❖勿低盐buffer洗膜❖胶中无EB现在是39页\一共有120页\编辑于星期日4.2.4Western杂交电泳,印迹,免疫学主要步骤SDS,blot杂交(AP或HRP)现在是40页\一共有120页\编辑于星期日Semi-drytransfersystem现在是41页\一共有120页\编辑于星期日现在是42页\一共有120页\编辑于星期日斑点杂交4.2.5现在是43页\一共有120页\编辑于星期日Allele-specificoligonucleotide(ASO)dot-blothybridizationcanidentifyindividualswiththesicklecellmutation.Theschematicdot-blotattopshowstheresultofprobingwithanASOspecificforthenormal-globinallele(A-ASO).Theresultsarepositive(filledcircle)fornormalindividualsandforheterozygotesbutnegativeforsicklecellhomozygotes(dashed,unfilledcircle).Thedot-blotatthebottomshowstheresultofprobingwithanASOspecificforthesicklecell-globinallele(S-ASO),andinthiscasetheresultsarepositiveforthesicklecellhomozygotesandheterozygotesbutnegativefornormalindividuals.TheA-andS-ASOweredesignedtobe19nucleotideslonginthiscasechosenfromcodons3to9ofrespectivelythesenseAandSglobingenesequencessurroundingthesicklecellmutationsite.Thelatterisasinglenucleotidesubstitution(A→T)atcodon6inthe-globingene,resultinginaGAG(Glu)→GTG(Val)substitution(seemiddlesequences).现在是44页\一共有120页\编辑于星期日制片探针制备杂交镜检、拍照4.2.6

FISH杂交现在是45页\一共有120页\编辑于星期日基因检测新技术使膀胱癌确诊提前“FISH技术在膀胱癌检测中的临床应用研究”,为期2年,对4809例患者开展了临床检测实验.结果:比临床常规检查,膀胱癌确诊提前36m杂交探针和检测试剂已实现国产化,质量稳定可靠,价格比进口产品降低近七成现在是46页\一共有120页\编辑于星期日4.2.7菌落(斑)原位杂交阳性重组子检测菌落→?文库菌斑→?文库现在是47页\一共有120页\编辑于星期日4.3PCR扩增技术链式反应动物单拷贝GSinceitsdiscoveryin1983thepolymerasechainreactionhasrevolutionizedmolecularbiology.Today,newformsofPCRandtherelatedtechniquesofcloningarefindingnewapplicationsatthecuttingedgeofbiomedicine.

现在是48页\一共有120页\编辑于星期日4.3.1基本原理离体合成几何级数平台效应现在是49页\一共有120页\编辑于星期日4.3.2反应体系模板引物Taq酶dNTPs缓冲液DNAormRNA模板纯度数量现在是50页\一共有120页\编辑于星期日引物的设计1630nt,GC含量连续互补碱基﹤3

3׳正确配对5׳可被修饰简并引物现在是51页\一共有120页\编辑于星期日耐热的DNApolTaq酶Pfu酶❖3→5校读❖高保真现在是52页\一共有120页\编辑于星期日缓冲液pH、离子强度Mg2+↓,酶活↓Mg2+↑,非特异↑引物退火现在是53页\一共有120页\编辑于星期日4.3.2基本过程变性退火延伸现在是54页\一共有120页\编辑于星期日扩增精确性的影响因素引物:1mol/LdNTPs:20~200mol/LMg+2:0.5~2.5mmol/Lhotstart现在是55页\一共有120页\编辑于星期日4.3.3PCR技术的改进nestedPCRinversePCRanchoredPCRRT-PCRinsituPCR实时定量PCR现在是56页\一共有120页\编辑于星期日1.巢式PCR嵌套引物外引物内引物现在是57页\一共有120页\编辑于星期日2.

反向PCRX、Y未知序列酶R消化环化再酶切扩增现在是58页\一共有120页\编辑于星期日反向PCR的特点难选适当的限制酶扩增的长度有限自身环化效率低现在是59页\一共有120页\编辑于星期日3.AnchoredPCR❖锚定引物A❖扩增❖产物鉴定现在是60页\一共有120页\编辑于星期日特点扩增未知序列无需酶切及连接操作简单特异性高现在是61页\一共有120页\编辑于星期日4.RT-PCR现在是62页\一共有120页\编辑于星期日5.原位PCR原位扩增,杂交,定量❖不需抽提模板❖灵敏度高100❖病毒检测、肿瘤发生率现在是63页\一共有120页\编辑于星期日通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时监测,实现对起始模板定量分析的方法6.实时荧光定量PCR现在是64页\一共有120页\编辑于星期日FRET技术;荧光标记探针扩增、杂交、光谱、实时检测荧光信号积累,起始模板量荧光定量PCR的原理现在是65页\一共有120页\编辑于星期日起点定量与终点定量起点天然重现性好终点加工误差大现在是66页\一共有120页\编辑于星期日荧光扩增曲线的三个阶段背景信号阶段指数扩增平台期现在是67页\一共有120页\编辑于星期日几个参数的确定①临界点②循环数(Ct)③标准曲线基线→阈值→Ct值→DNA0阈值缺省:3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍现在是68页\一共有120页\编辑于星期日Log浓度与循环数的关系起始数越多,Ct值越小标准曲线→样品Ct值→初始模板量现在是69页\一共有120页\编辑于星期日DNA产物的荧光标记非特异性荧光标记SYBRGreenI特异性荧光标记TaqMan探针分子信标现在是70页\一共有120页\编辑于星期日①SYBRGreen法只有和dsDNA结合后才发荧光变性时,DNA双链分开,无荧光现在是71页\一共有120页\编辑于星期日延伸结束阶段采集荧光信号与非特异的dsDNA结合发光,必须在反应结束时做融解曲线分析现在是72页\一共有120页\编辑于星期日SYBRGreen融解曲线分析现在是73页\一共有120页\编辑于星期日PCR反应体系的建立及优化染料:太高抑制Taq酶活性;太低,荧光信号太弱,不易检测引物:扩增有杂带,定量不准Mg2+:1.5mM,减少非特异性产物T&T:由酶和引物决定现在是74页\一共有120页\编辑于星期日SYBRGreen法优缺点对模板无选择性使用方便,无需探针灵敏;便宜非特异性结合,产生假阳性对引物特异性要求较高现在是75页\一共有120页\编辑于星期日5-R;3荧光淬灭基团(Q)探针完整,R发射的荧光能量被Q吸收,无荧光;R与Q分开,发荧光Taq酶:5→3外切酶活性②TaqMan法现在是76页\一共有120页\编辑于星期日TaqMan水解型杂交探针原理当一个荧光分子(供体)的荧光光谱与另一个荧光分子(受体)的激发光谱相重叠时,供体荧光分子自身的荧光强度衰减,FRET现在是77页\一共有120页\编辑于星期日荧光共振能量转移现在是78页\一共有120页\编辑于星期日扩增1条DNA→释放1个荧光分子→荧光信号的累积与PCR产物同步现在是79页\一共有120页\编辑于星期日TaqMan法PCR反应的建立PP的设计:探针Tm为70℃,<30bp,5’非G;引物Tm为60℃反应参数:

95℃3,94℃15s,60℃60s,40循环PP优化:获得最小Ct值,最大信号/背景比值primer:

50-900nM;probe:50-250nM现在是80页\一共有120页\编辑于星期日TaqMan法优缺点对目标序列的高特异性引物设计相对简单重复性比较好只适合一个特定的目标委托公司标记,价格较高现在是81页\一共有120页\编辑于星期日③分子信标与扩增产物结合产生荧光,信号的强弱→靶序列的多少现在是82页\一共有120页\编辑于星期日发夹型荧光探针R与Q接近,产生FRET探针-模板配对,构象改变R与Q分离→荧光现在是83页\一共有120页\编辑于星期日荧光定量PCR的特点实时检测特异性强定量精确无需跑胶现在是84页\一共有120页\编辑于星期日4.4DNA测序化学降解法末端终止法现在是85页\一共有120页\编辑于星期日G反应:DMS使G、A甲基化G+A:哌啶使G断裂T+C:肼使嘧啶环断开,哌啶除去碱基C反应:高盐下,仅C与肼反应,C末端

1.Maxam-Gilbert化学降解法现在是86页\一共有120页\编辑于星期日现在是87页\一共有120页\编辑于星期日距标记末端250nt非酶促合成测序,无需引物对合成的寡核苷酸测序蛋白质与DNA的相互作用特点现在是88页\一共有120页\编辑于星期日2.Sanger酶学法现在是89页\一共有120页\编辑于星期日基本步骤模板纯化测序反应模板,引物,Pol,

dNTPs(dd)4个反应→4组产物PAGE→自显影→X光片上样电泳放射自显影现在是90页\一共有120页\编辑于星期日现在是91页\一共有120页\编辑于星期日测序与PCR的比较测序PCR引物1条1对合成线性指数底物dNTP和dddNTP产物系列长度片段1条带现在是92页\一共有120页\编辑于星期日CAGTtemplateprimerdATP,dNTPpolymeraseterminator3.DNA全自动测序同位素标记荧光标记❖单色荧光❖多色荧光现在是93页\一共有120页\编辑于星期日时间长序列短污染大操作难放射自显影胶图现在是94页\一共有120页\编辑于星期日现在是95页\一共有120页\编辑于星期日多色荧光标记templateprimerdNTPpolymeraseterminatorCGTA现在是96页\一共有120页\编辑于星期日ABIPrism3100-Avant现在是97页\一共有120页\编辑于星期日遗传分析仪的多种应用现在是98页\一共有120页\编辑于星期日基本步骤模板的纯化与定量测序反应—PCR仪产物的纯化与变性上样电泳—测序仪结果分析现在是99页\一共有120页\编辑于星期日AutomatedDNAsequencingwithfluorescentlylabeledddNTP.(A)Thechainterminationreactionsarecarriedoutinasingletube,witheachddNTPlabeledwithadifferentfluorophore.Intheautomatedsequencer,thebandsintheelectrophoresisgelmovepastafluorescencedetector,whichidentifieswhichddNTPispresentineachband.Theinformationispassedtotheimagingsystem.(B)Theprintoutfromanautomatedsequencer.Thesequenceisrepresentedbyaseriesofpeaks,oneforeachnucleotideposition.Inthisexample,agreenpeakisan'A',blueis'C',blackis'G',andredis'T'.现在是100页\一共有120页\编辑于星期日现在是101页\一共有120页\编辑于星期日4.DNA测序技术进展现在是102页\一共有120页\编辑于星期日传统测序技术的缺陷及新进展序列不可能太长费时费力准确度不高结构复杂序列杂交法质谱法DNA芯片法单分子法现在是103页\一共有120页\编辑于星期日现在是104页\一共有120页\编辑于星期日4.5DNA的定点诱变盒式取代切除;合成;转化olig介导PCR诱变现在是105页\一共有120页\编辑于星期日olig片段退火合成转化olig介导的诱变现在是106页\一共有120页\编辑于星期日OligonucleotidemismatchmutagenesiscancreateadesiredpointmutationatauniquepredeterminedsitewithinaclonedDNAmolecule现在是107页\一共有120页\编辑于星期日P

C

R

诱变现在是108页\一共有120页\编辑于星期日现在是109页\一共有120页\编辑于星期日4.6

DNA与蛋白质互作分析Y2HsystemY1HsystemgelretardationassaysDNaseIfootprinting现在是110页\一共有120页\编辑于星期日1.酵母双杂交(Y2H)GAL4proteinBD与UAS结合AD激活lacZ单独不起作用GAL1UAS启动子lacZreporter现在是111页\一共有