血管狭窄后切应力诱导内皮细胞组织因子表达的实验,病理学论文

血管狭窄后切应力诱导内皮细胞组织因子表达的实验,病理学论文研究表示清楚，当血管壁的完好性遭到毁坏时，狭窄局部的血管壁切应力(wallshearstress，WSS)过高导致与血流接触的内膜损伤，能够诱发内皮细胞异常表示出组织因子(tissuefactor，TF)［1，2，3，4］。本研究应用套扎法建立大鼠颈总动脉狭窄模型，应用免疫组化和原位杂交法结合图像分析，对血管狭窄后切应力诱导内皮细胞TF早期表示出规律进行了初步在体研究。1材料与方式方法1.1实验动物与分组SPF级SD雄性大鼠45只，质量32018.5g，由第三军医大学实验动物中心提供。随机数字法分为对照组(C组，n=5)、狭窄组(S组，n=40)，狭窄组分0.25、0.5、1、2、4、8、16、24h，8个时相点，每个时相点各5只大鼠。1.2狭窄模型制作及标本采集以2.5%戊巴比妥钠40mg/kg体重腹腔注射麻醉，待静卧后睫毛反射消失，仰位固定。无菌条件下，颈部备皮消毒后，颈部正中行长约2.5cm纵行切口，逐层分离，游离出左侧颈总动脉中段长8～10mm，套入纵形剖开的内径约0.3mm，长3mm的硅胶管，外用4号丝线双重扎紧，复位后缝皮。分别在术后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h，8个时相点，使用TS420型多普勒血流仪，1.5prb探头，检测狭窄下游5mm内的每分平均血流量Q，检测时小心游离出颈总动脉外膜的疏松结缔组织，保持探头与血流方向垂直，每例检测约5～10min，待显示平稳时记录数字，得到每分平均血流量Q。随后在Digitex数字减影血管成像系统下，仰位固定，用自制导管(直径约1.5mm)刺入左心室，快速注射1ml碘fo醇(240mg/ml)，即时进行正位数字减影血管造影(Digitalsubtractionangiography，DSA)，测量正常和狭窄血管内经D，计算出狭窄程度。C组只分离左颈总动脉，进行Q和D值的测量。随后采用复合固定液(4%多聚甲醛，1DEPC，0.1mol/LPBS，pH7.4)约30ml直接低压灌注，0.1h后取下狭窄段血管固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，常规石蜡包埋，切片厚度6m。1.3切应力计算把测得在体血管内径(D)和每分平均血流量(Q)代入Poiseiulle流体公式计量动脉平均壁切应力:Tw=32Q/D3(血液黏稠度=0.035dynes.s/cm2.5］)。1.4TFmＲNA采用原位杂交法检测石蜡切片常规脱蜡至水并水化后，参照试剂盒讲明，3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37.0℃消化0.5h，预杂交液恒温箱40.0℃6h，TF寡核苷酸探针(MK3023，武汉博士德生物工程公司提供)，杂交液恒温箱内42.0℃杂交8h，封闭液37.0℃孵育0.5h，生物素化鼠抗地高辛37.0℃孵育1.0h，滴加SABC复合物37.0℃孵育0.5h，生物素化过氧化酶37.0℃孵育0.5h，DAB显色(试剂盒AＲ1022，武汉博士德生物工程公司提供)。按试剂盒提供的已经知道阳性片作为阳性对照，以PBS代替杂交液作为阴性对照。TFmＲNA阳性结果为细胞浆出现棕黄色颗粒。1.5TF蛋白采用免疫组织化学染色检测石蜡切片脱蜡至水并水化，参照试剂盒讲明，3%过氧化氢室温下孵育0.25h，浸入0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，微波炉中火加热至沸腾，反复3次，每次间隔0.1h，10%羊血清37.0℃孵育0.25h，分别参加一抗兔抗TF多克隆抗体(BA1714，武汉博士德生物工程公司提供，稀释度1∶120)，4.0℃冰箱放置8h，生物素标记的山羊抗兔IgG抗体(二抗)20.0℃孵育0.5h，链霉菌抗生物蛋白-过氧化物酶溶液20.0℃孵育0.5h，DAB显色(试剂盒AＲ1022，武汉博士德生物工程公司提供)。按试剂盒提供的已经知道阳性片作为阳性对照，以PBS代替杂交液作为阴性对照。TF阳性结果为细胞胞浆着色，呈棕黄色。1.6图像分析以细胞浆出现的棕色细颗粒为阳性染色，采用LeicaQwin病理图像分析系统测定阳性表示出物的平均灰度值(meangray，MG)，灰度值0(黑色，表示出最强)，255(白色，无表示出)。每张切片测量前均用该片空白区校正并调节光亮度，以到达不同指标测量标准一样。本实验各组切片空白区灰度值平均为245，每组抽取5张切片，在630光镜下随机选取4个区域，测定内膜的MG，以相对平均灰度值(ＲMG)表示，即阴性对照MG减去实验MG。1.7统计学分析数据以均数标准差(xs)表示，SPSS16.0统计软件处理，组间均数比拟用单因素方差分析，以P＜0.05确定有显着性。2结果2.1血流量和切应力变化DSA测得静息状态下大鼠左颈动脉正常血管内径为1.140.05mm，各组狭窄血管内径为0.210.02mm，本模型的平均狭窄率为82%。静息状态下大鼠左颈动脉狭窄前和狭窄后各时相血流量见表1。对照组和狭窄组的血流量和切应力有显着性差异(P＜0.01)，狭窄后各组间血流量和切应力无显着性差异(P＞0.05)。2.2TFmＲNA转录和蛋白的表示出变化正常对照组颈总动脉内膜内皮细胞的TFmＲNA和蛋白有微量表示出，狭窄0.25h后，检测到颈动脉内膜内皮细胞表示出的TFmＲNA和蛋白加强(P＜0.01)，主要存在于胞浆，随着狭窄时间的延长，阳性细胞数及着色程度逐步增加，狭窄后4h到达峰值(P＜0.01，表2)，以后逐步下降，但各时相点与正常组相比均显着升高(P＜0.01)，狭窄后24h，相对平均灰度值仍然高于对照组(P＜0.01，表2)。3讨论血液动力学作用在新生血管构成、血管壁构造重建以及动脉粥样硬化的发生发展中起着肯定性的作用［6］。血流作用于动脉的力能够分解成两个主要的向量［7，8］:一是垂直于管壁的代表压力的向量，二是作用于内皮细胞外表与管壁平行因血液的沾滞性而产生的摩擦力，即WSS。血管壁的所有成份(内皮细胞、平滑肌细胞、细胞外基质等)都承受脉动压力产生的伸张，但内皮细胞外表所承受的力以WSS为主［［9，10］。硅胶管套扎大鼠颈总动脉中段造成的狭窄不损伤血管内膜［11］，大鼠左颈内动脉的近心段长直均匀且无分支，能够应用Poiseiulle流体公式计量平均WSS［5］。运用数字减影血管造影和多普勒血流仪能精到准确地测量在体血管内径和每分平均血流量，计算出准确的狭窄程度和切应力。本模型造成的狭窄到达重度，局部切应力比狭窄前加强了3.8倍，15min后TF的mＲNA转录和蛋白开场表示出，证实了局部的切应力过高导致血管内膜损伤，是诱发内皮细胞异常表示出组织因子，导致血栓构成和斑块产生［5，12，13］。体外研究表示清楚，内皮细胞TFmＲNA和蛋白在基础状态下几乎检测不到，给予切应力诱导后表示出上调，讲明TF基因上调的诱发与内皮细胞的切应力变化有关［14，15］。本实验在大鼠颈总动脉狭窄段的高切应力区观察到内膜的TF的mＲNA转录和蛋白表示出均明显加强，约4h到达峰值，讲明只要血管局部狭窄，造成血流紊乱，切应力发生了改变，就能够早期诱导TF基因表示出。体外实验研究表示清楚，这可能主要与即早基因家族(immediateearlygenes，IEGs)的Egr-1和Sp1有关［15］，转录因子核因子ppa-B(NF-B)和活化蛋白-1(AP-1)活化后可以以介入其上调［16］。多种因素使内皮细胞TF基因表示出上调，血管损伤后，在多种炎性因子如白介素-1(IL-1)、脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、干扰素(INF)、内皮细胞黏附分子-1(ICAM-1)、前列环素(PGI2)等作用下，血管内皮细胞TF基因表示出可以以加强［17-20］。以下为参考文献［1］KAWAHAＲAD，MATSUDAT.Hydrodynamicshear-stress-dependentretentionofendothelialandendothelialprogenitorcellsadheredtovascularendothelialgrowthfactor-fixedsur-faces［J］.BiomedMaterＲesBApplBiomater.2020，100(5):1218-1228.［2］DELAPAZNG，WALSHETE，LEACHLL，etal.Ｒoleofshear-stress-inducedVEGFexpressioninendothelialcellsurvival［J］.CellSci，2020，15;125(4):831-843.［3］MAZZOLAIL，SILACCIP，BOUZOUＲENEK，etal.Tissuefactoractivityisupregulatedinhumanendothelialcellsex-posedtooscillatoryshearstress［J］.ThrombHaemost，2002，87(6):1062-1068.［4］G