大气压等离子体射流对黑素瘤作用的研究,皮肤病学论文

大气压等离子体射流对黑素瘤作用的研究,皮肤病学论文黑素瘤作为一种起源于皮肤、粘膜、眼和中枢神经系统色素沉积区域的黑色素细胞的高度恶性肿瘤，是一种由异常黑色素细胞过度增生引发的常见皮肤恶性肿瘤，是皮肤癌的前期异常感觉和状态[1-3].在所有的皮肤恶性肿瘤中黑素瘤的发病率居第三位，占皮肤肿瘤死亡病例的极大部分，近年来国内外发病率呈不断上升趋势。当前治疗黑素瘤的主要方式方法是是外科手术切除和放化疗，然而手术创伤大，局部广泛切除后还需再进行植皮手术，放化疗则副反响大，在杀灭肿瘤细胞的同时也杀灭了正常细胞。近年来，低温等离子体〔LowTemperaturePlasma,LTP〕在生物医学领域的应用越来越广泛，主要集中在废液废气、医疗器械、食品等的消毒灭菌和改善医用生物材料的生物相容性等方面，已获得了显着的成效，被国内外大量研究所证实[4].同时，LTP也逐步开场应用于对人和动物活细胞的处理，人们尝试着使用LTP来取代或者辅助传统的医疗手段和医疗器械，已初步获得了一些令人满意的成果[5].但传统的LTP源因产生的等离子体位于两个电极之间或放电效率和活性粒子浓度较低，无法作用于实际人或动物身上的活体细胞或处理效率特别低。因而研究者们利用气流和电场的共同作用开发了一种新颖的LTP产生方式方法，即大气压等离子体射流〔AtmosphericPressurePlasmaJet,APPJ〕，将放电区域所产生的等离子体从射流管口喷出。相比于传统的LTP产生方式方法，APPJ具有无需密封系统、放电区域与工作区域分离、活性粒子可随气流而作用于对象外表、便于调控和处理三维复杂曲面构造的对象等优点，已逐步被人们应用于生物医学领域、材料外表改性、外表刻蚀、薄膜制备等领域，表现出独特的技术优势和良好的应用前景[6-8].由于APPJ可精到准确定位于肿瘤组织，进而避免对正常细胞和组织的毁坏，具有创伤小和副反响小的优点。因而如可采用APPJ等手段，来代替手术切除、化疗等常用医疗手段或医疗器械，不仅能够减轻药物所带来的副作用和化疗手段所带来的宏大疼痛，还能够到达经济有效治疗的目的。本实验首先通过两种APPJ装置，将小鼠体外黑素瘤作为APPJ作用的研究对象，通过对等离子体参数与成分的诊断和作用前后黑素瘤细胞相关参数〔存活数、细胞周期分布、凋亡率和黑素含量合成等〕的检测，来考察和探寻求索APPJ对黑素瘤细胞生长的抑制作用及相关机制。有望为APPJ治疗皮肤恶性肿瘤提供理论基础，并期望提出治疗恶性肿瘤可能的新方式方法，进而减少疾病的折磨，造福于社会。1大气压等离子体射流对黑素瘤作用的研究1.1实验方式方法实验中选用小鼠黑素瘤细胞〔B16〕进行体外培养，所使用培养液为RPMI-1640细胞培养液〔含10%小牛血清，100U/mL青霉素与0.1mg/L链霉素〕，置于37℃，5%CO2孵育箱孵育，每三天更换一次培养液，次，待成纤维细胞长满瓶壁，用0.25%胰蛋白酶消化，并用PBS将细胞浓度调至1106/mL.培养完毕后将细胞从培养瓶壁上消化下，离心后参加培养液进行吹打，随后将含有细胞的培养液参加医用96孔板，因96孔板的孔径与石英管APPJ的大小差不多，因而我们选用了石英管ArAPPJ置于96孔板上方来处理小鼠黑素瘤细胞。实验在常气压下的超净工作台中进行。试验环境条件为：室温20℃，相对湿度60%.实验数据以SD〔均数标准差〕形式表示，均数间的差异采用随机区组方差分析方式方法检验，采用SPSS13.0统计软件分析。1.2实验结果与分析1.2.1细胞存活能力、酪氨酸酶活性及黑色素含量的检测采用四唑盐比色实验来检测细胞的存活能力，所用的显色剂为噻唑蓝，简称为MTT.在一定细胞数范围内，MTT结晶构成的量与细胞数成正比，用以检测等离子体能否对癌细胞总量有减少或抑制作用。黑色素合成能力的检测采用酪氨酸酶活性实验。黑色素含量则用于判定APPJ处理能否减少了黑素瘤细胞的合成黑色素量。以上三种方式方法在不同APPJ处理时间下的检测结果均通过分光度来表示，如此图4所示。可见，以上三种检测实验的OD值均随着APPJ处理时间的增长而逐步减小，意味着细胞存活能力、黑色素合成能力及黑色素含量快速下降，黑素瘤细胞的生长和活性得到了一定程度的抑制。当APPJ处理时间4s以上，相比于控制组，三种检测实验的OD值开场剧烈下降，差异有统计学意义〔P0.05〕。【1】1.2.2电子透射电镜的观察利用电子透射电镜〔TEM〕观察APPJ处理前后黑素瘤细胞的形貌变化情况。详细步骤如下：将经APPJ处理后的悬浊液，在3000g下离心10min,弃去上清液；沉淀由PBS清洗3次，每次3000g,5min;参加2mL戊二醇〔2.5%〕在4C下固定24h,之后用0.1M的PBS浸洗30min;参加2.5%的四氧化锇在4C下固定2h后，用0.1M的PBS浸洗10min,乙醇梯度脱水；环氧树脂Epon812浸透、包埋，聚合后利用超薄切片机〔瑞典LKB-V〕进行超薄切片50~70nm,作超薄切片；醋酸铀、柠檬酸铅染色后，透射式电子显微镜〔日本日立H-600〕下观察、拍照。如此图2所示。可见，大部分细胞的细胞壁和细胞膜破裂，细胞内物质逸出；并且比照图5〔b〕和图5〔d〕的细胞器图可见，经APPJ处理之后，细胞的线粒体、内质网大大减少，整个细胞器变得空旷。1.2.3细胞凋亡率检测细胞凋亡是指细胞在特定的内源和外源信号诱导下，其死亡途径被激活，并在有关基因的调控下发生的程序性死亡经过。凋亡细胞数目越多，则讲明等离子体处理对癌细胞生长有抑制作用，促进其细胞凋亡，有助于减缓癌细胞疯长，减轻患者异常感觉和状态。通过将细胞悬液离心、参加缓冲液后置于488nm氩离子激光器检测，检测结果如表1.可见，当APPJ处理时间高于4s之后，黑素瘤细胞中凋亡细胞的百分比快速增大，6s之后坏死细胞的百分比也快速增大，这讲明APPJ只需处理6s以上就可杀灭绝大部分的黑素瘤细胞。【2】1.3APPJ作用黑素瘤细胞的机理讨论从实验结果和分析中可知，APPJ可快速〔几s内〕杀死黑素瘤细胞，毁坏细胞壁和膜，抑制黑素瘤细胞的生长，这表示清楚这是APPJ中的某种物质能够毁坏细胞壁和细胞膜，使得细胞壁和细胞膜破裂，线粒体和内质网大大减少，并使得细胞质从细胞中泄漏出来，抑制黑素瘤细胞的活性、合成能力与生长，使细胞趋于凋亡和坏死。因ArAPPJ为低温等离子体，通过红外测温可知其温度约在室温范围，因而温度效应能够基本忽略。由图3可知，ArAPPJ中包含的作用于生物细胞的活性成分包括紫外线、带电粒子〔电子、阴阳离子如N2+〕以及活性氧和活性氮种〔reactiveoxygenandnitrogenspecies,RONS,比方OH自由基、原子态氧、激发的N2和O3〕。由于在大气压下的APPJ中，紫外线可被等离子体和周围空气吸收，不能到达被处理的样品外表，所以紫外线的作用在APPJ对生物细胞的处理经过中可以以忽略。因而，国内外多数研究者以为RONS在大气压LTP对生物细胞的处理经过中发挥主要作用[9,10].在APPJ中，RONS能够到达被处理的细胞样品外表，因而我们同样基本以为RONS对黑素瘤细胞作用效果最大。在细胞信号转导级联、蛋白泛素化及降解、细胞骨架以及细胞周期调控蛋白等系统都介入RONS的细胞周期调控作用。RONS的增加激活了p21Cip1的表示出并导致细胞周期G1期阻滞，这种G1期细胞周期阻滞最终导致了细胞凋亡。2结论利用所开发的两种ArAPPJ装置，结合等离子体参数与成分的诊断，以及作用前后黑素瘤细胞相关参数〔存活数、细胞周期分布、凋亡率和黑素含量合成等〕的检测，研究了APPJ对小鼠黑素瘤细胞〔B16〕的抑制作用及相关机制。得到了如下结论：两种ArAPPJ应用安全可靠，且富含OH自由基；APPJ处理可毁坏黑素瘤细胞壁和细胞膜，大大减少细胞的线粒体和内质网，抑制黑素瘤细胞的生长和活性，使细胞趋于凋亡和坏死，讨论以为APPJ中的RONS发挥了主要的抑制作用；以下为参考文献[1]廖怀伟,刘丽忠,文辉才.皮肤黑色素瘤的治疗新进展[J].中华实验外科杂志,28〔11〕：2020-2021,2018.[2]韩睿,程浩,朱可建.恶性黑素瘤38例临床分析[J].中国皮肤性病学杂志,28〔7〕：477-478,2007.[3]朱健伟,骆丹.黑素瘤细胞粘附与迁移相关外表分子研究进展[J].肿瘤基础与临床,19〔6〕：531-534,2006.[4]Kedzierski