抗生素类药物的分析专业知识讲座专家讲座

第十一章抗生素类药品分析Rturn抗生素类药物的分析专业知识讲座第1页思索与练习第一节概述第二节β–内酰胺类抗生素

第三节氨基糖苷类抗生素第四节四环素类抗生素第五节抗生素类药品中高分子杂质检验基本要求抗生素类药物的分析专业知识讲座第2页基本要求一、掌握抗生素类药品结构特点与分析方法之间关系。二、掌握抗生素类药品判别原理与方法。三、掌握抗生素类药品法定含量测定方法原理、测定方法与计算。四、熟悉抗生素类药品杂质检验方法。五、了解抗生素类药品中高分子聚合物检验。Return抗生素类药物的分析专业知识讲座第3页第一节概述1.抗生素药品特点化学纯度较低活性组分易发生变异稳定性差抗生素类药物的分析专业知识讲座第4页2.微生物学法与理化法比较微生物检定法理化法以抗生素对微生物杀伤或抑制程度为指标衡量抗生素生物效价

依据抗生素结构特点，利用其特有理化性质测定其含量已知或新发觉抗生素、精制品或粗制品均能测定

测定化学结构已知、已提纯抗生素灵敏度高、样品需用量小、反应抗抗生素医疗价值，但操作步骤多、费时、误差大

快速、准确、专属性高、样品需用量小、操作简单、省时抗生素类药物的分析专业知识讲座第5页生物学方法：测定抗生素抑菌或杀菌能力优点1、与临床效果一致2、灵敏度高3、干扰物质少1、操作繁琐2、培养时间长3、测定误差大缺点化学及物理化学方法1.准确度高2.简单、快速优点不一定代表生物效价2。易受杂质干扰缺点抗生素类药物的分析专业知识讲座第6页抗生素效价测定管碟法：系利用抗生素在琼脂培养基内扩散作用，比较标准品与供试品二者对接种试验菌产生抑菌圈大小，以测定供试品效价一个方法。抗生素类药物的分析专业知识讲座第7页3.抗生素活性以效价单位来表示：每ml或每mg中含有某种抗生素有效成份多少，用单位（u）或µg表示。

1mg青霉素G钠盐定为1667单位

1mg青霉素G钾盐单位（u）=1667×356.4/372.5=1595u/mg抗生素类药物的分析专业知识讲座第8页分类（按结构与性质）：β–内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类林可霉素类、其它抗生素类Return抗生素类药物的分析专业知识讲座第9页第二节β–内酰胺类抗生素

青霉素类NSCH3CH3COOHOHN1234567RCOAB母核：6-氨基青霉烷酸侧链：脂酰基结构特点：

β-内酰胺氢化噻唑环-COOH

3个手性碳原子抗生素类药物的分析专业知识讲座第10页头孢菌素类AB母核：7-氨基头孢菌烷酸侧链：脂酰基结构特点：β-内酰胺、氢化噻嗪环、-COOH

2个手性碳原子、O=C8-N5-C4=C3共轭结构抗生素类药物的分析专业知识讲座第11页青霉素（青霉素钾、钠）抗生素类药物的分析专业知识讲座第12页氨苄西林

（氨苄青霉素）抗生素类药物的分析专业知识讲座第13页阿莫西林

（羟氨苄青霉素）抗生素类药物的分析专业知识讲座第14页普鲁卡因青霉素抗生素类药物的分析专业知识讲座第15页头孢氨苄抗生素类药物的分析专业知识讲座第16页头孢拉啶抗生素类药物的分析专业知识讲座第17页头孢羟氨苄抗生素类药物的分析专业知识讲座第18页头孢噻吩钠抗生素类药物的分析专业知识讲座第19页酸性结构特点与性质一、Na与碱金属(Na+、K+)成盐

（一）羧基

易溶于水

抗生素类药物的分析专业知识讲座第20页与有机碱(普鲁卡因)成盐

难溶于水普鲁卡因青霉素抗生素类药物的分析专业知识讲座第21页（二）手性C

头孢菌素类

C6C7青霉素类C3C5C6

旋光性﹡﹡﹡﹡﹡抗生素类药物的分析专业知识讲座第22页

（三）共轭体系

头孢菌素类母核有共轭体系

青霉素类母核无显著UV多数有苯环取代基

UV抗生素类药物的分析专业知识讲座第23页

青霉素类头孢菌素类青霉素钠UV7-20头孢氨苄264nm260nm抗生素类药物的分析专业知识讲座第24页（四）β–内酰胺环

水溶液不稳定

干燥纯净稳定

不稳定性原因四元环张力大

酰胺键易水解

抗生素类药物的分析专业知识讲座第25页青霉素类

一些氧化剂酸、碱、青霉素酶（一些金属离子）（温度）降解失效抗生素类药物的分析专业知识讲座第26页例青霉素降解反应青霉素羟肟酸衍生物强酸性完全水解青霉酸中强酸性pH=2不完全水解或100℃青霉烯酸弱酸性pH4青霉胺(2)CO2青霉醛(1)+增强酸度1+2+强性或加热不完全水解碱性或青霉素酶羟胺碱性OH-或100℃增强酸度红色络合物脱羧青霉噻唑酸强性或加热抗生素类药物的分析专业知识讲座第27页头孢菌素类酸、碱、胺类-内酰胺酶降解失效抗生素类药物的分析专业知识讲座第28页（一）呈色反应1.羟肟酸铁反应β-内酰胺类呈色羟肟酸衍生物Fe3+/3H+判别试验NaOH•2HClNOHH-b内酰胺类抗生素类药物的分析专业知识讲座第29页H+Fe3+/3（红、棕、褐）抗生素类药物的分析专业知识讲座第30页2.类似肽键反应茚三酮反应α-氨基-氨基茚三酮蓝紫色抗生素类药物的分析专业知识讲座第31页

双缩脲反应似肽键（开环分解）-内酰胺类碱性酒石酸铜紫抗生素类药物的分析专业知识讲座第32页其它呈色反应与重氮苯磺酸反应橙黄色重氮苯磺酸--56OHHC（偶合）酚羟基头孢哌酮抗生素类药物的分析专业知识讲座第33页与变色酸（1,8-二羟基萘-3,6-二磺酸）-硫酸反应青霉素阿莫西林氨苄西林150℃（缩合）褐色抗生素类药物的分析专业知识讲座第34页与H2SO4-HNO3反应头孢菌素类抗生素类药物的分析专业知识讲座第35页与铜盐反应NaOH橄榄绿色青霉素钾（钠）氨苄西林与H2SO4–HCHO反应H2SO4–HCHO△暗黄色红棕色抗生素类药物的分析专业知识讲座第36页1.K+、Na+火焰反应（二）各种盐反应

焰色→鲜黄色

Na+

焰色→紫色

K+抗生素类药物的分析专业知识讲座第37页2.沉淀反应（青霉素盐）遇酸→↓在过量HCl或有机溶剂中溶解白青霉素青霉素钠

青霉素钾

緘+H抗生素类药物的分析专业知识讲座第38页3.重氮化-偶合反应

重氮化-偶合反应芳伯氨基抗生素类药物的分析专业知识讲座第39页4.与三硝基苯酚反应—测定熔点

△二苄基乙二胺抗生素类药物的分析专业知识讲座第40页mp三硝基苯酚抗生素类药物的分析专业知识讲座第41页光谱法（三）1、UV法样品、分解产物Cu2+头孢氨苄λmax=262nm青霉素V钠A280nm/A264nm=1.30～1.50抗生素类药物的分析专业知识讲座第42页pH3.8分子重排苯唑西林钠苯唑青霉烯酸抗生素类药物的分析专业知识讲座第43页抗生素类药物的分析专业知识讲座第44页2、IR法3180cm-1酰胺N-H1780cm-1β–内酰胺C=O3470cm-1酚羟基O-H1690cm-1仲酰胺C=O1250cm-1酚羟基C-O以阿莫西林为例抗生素类药物的分析专业知识讲座第45页色谱法（四）1、TLC法对照品对照法2、HPLC法抗生素类药物的分析专业知识讲座第46页三、杂质检验

药品

检验项目

检验方法

头孢他啶聚合物HPLC法

头孢曲松钠

头孢哌酮钠

头孢噻肟钠

头孢呋辛酯相关物质和异构体HPLC法

头孢氨苄相关物质反相TLC法

青霉素钾（钠）吸收度紫外分光光度法

抗生素类药物的分析专业知识讲座第47页1.头孢他啶聚合物测定

固定相：葡聚糖凝胶G-10（40~120µm）

流动相A：3.5%硫酸铵0.01mol/L磷酸盐缓冲液

流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠

对照品溶液：头孢他啶对照品100µg/ml

抗生素类药物的分析专业知识讲座第48页1）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用1mg/ml蓝色葡聚糖、流动相A测定；重复性用对照品溶液、流动相B测定。

N不低于900，拖尾因子0.75~1.5，峰面积RSD应小于5.0%。

2）测定方法

进样供试液，用流动相A；进样对照液，用流动相B。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超出0.3%。抗生素类药物的分析专业知识讲座第49页2.头孢呋辛酯中相关物质和异构体检验

固定相：ODS

流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）

1）头孢呋辛酯Δ2-异构体制备：头孢呋辛酯对照品+流动相头孢呋辛酯Δ2-异构体。

2）系统适用性试验：各异构体之间R>1.5，以头孢呋辛酯A异构体计算n>1500。抗生素类药物的分析专业知识讲座第50页

3）异构体：t‘R1

相对保留时间r12=-----1----被测物

t’R22----标准物异构体相对保留时间判断B异构体0.85供试液谱图中A异构体峰面积A异构体1.0与A、B异构体峰面积和之比应为0.48~0.55。抗生素类药物的分析专业知识讲座第51页3.头孢氨苄中相关物质检验---反相TLC法

固定相：活化后硅胶G板置5%（V/V）正十四烷正己烷溶液中，展至顶部，凉干展开剂：0.1mol/L枸橼酸-0.2mol/L磷酸氢二钠-丙酮（120：80：3）

供试液：本品50mg/ml

对照液（1）：本品0.5mg/ml

对照液（2）：α-苯甘氨酸0.5mg/ml

对照液（3）：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸0.5mg/ml

抗生素类药物的分析专业知识讲座第52页结果判断：供试液如显杂质斑点，与对照液（2）（3）位置相同上所斑点比较，其颜色不得更深；如显其它杂质斑点，与对照液（1）所显主斑点比较，其颜色不得更深。

抗生素类药物的分析专业知识讲座第53页4.青霉素钠（钾）吸收度检验：供试液1.80mg/ml，

结果判断：A280不得大于0.10抗生素类药物的分析专业知识讲座第54页-8I24I碘量法（一）1.原理水解产物定量过量剩下ChP四、含量测定（水解）NaOH头孢菌素族青霉素族抗生素类药物的分析专业知识讲座第55页反应分两步进行：1.水解反应(按化学计算量进行)2.氧化-还原反应(无固定量关系，受温度、PH值和时间等原因影响，应严格控制反应条件并采取标准品平行对照测定)抗生素类药物的分析专业知识讲座第56页第一步第二步抗生素类药物的分析专业知识讲座第57页V样空V样对照液+缓冲液+碘液+回滴+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴

V对空V对2.方法供试液+缓冲液+碘液+回滴+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴抗生素类药物的分析专业知识讲座第58页

空白试验A、消除样品已降解产物干扰B、消除样品中其它消耗碘杂质干扰C、消除碘挥发造成误差

以未经水解样品作空白测定抗生素类药物的分析专业知识讲座第59页空白样品I2Na2S2O3I-I2抗生素类药物的分析专业知识讲座第60页

采取标准品平行对照测定A、可消除温度、pH、操作、环境等条件影响B、使本法测定结果与微生物检定法一致抗生素类药物的分析专业知识讲座第61页3.条件（1）弱酸性pH4.5碱↑I2→IO3-+I-酸↑普鲁卡因与碘在酸性条件下会产生复盐沉淀（2）温度24～26℃温度＞38℃

未水解供试品亦消耗碘抗生素类药物的分析专业知识讲座第62页（3）水解时间以水解20分钟后耗碘量最大（4）反应时间反应20分钟后，耗碘量随时间改变较小，可减小含量测定误差。抗生素类药物的分析专业知识讲座第63页4.特点（1）灵敏度高样品:碘=1:8（2）反应条件、试验操作要求高V对、V对空V样、V样空1份含量加试剂次序、反应时间、滴定速度相同4I2→8I-抗生素类药物的分析专业知识讲座第64页5.计算原料制剂S0、S-供试品空白液、供试品消耗硫代硫酸钠体积R0、R-对照空白液、对照品消耗硫代硫酸钠体积U0、U-样品标示量、对照品效价（单位/mg）C-对照品浓度（g/mL）W、D-供试品取样量（g）、稀释倍数抗生素类药物的分析专业知识讲座第65页电位配位滴定法（汞量法）（二）1.原理青霉素族ChPNaOHHNO3Hg2+配位化合物抗生素类药物的分析专业知识讲座第66页2.方法醋酸盐缓冲液pH4.6滴定水解(降)空醋酸盐缓冲液V(NO3)2HgpH4.6滴定样品以未经水解样品作空白测定抗生素类药物的分析专业知识讲座第67页3、讨论（1）水解必须完全（2）空白试验消除已降解产物干扰（2）优点

不需标准品抗生素类药物的分析专业知识讲座第68页可见-紫外分光光度法（三）1、酸水解--铜盐法稳定剂nmCupHA3204+2青霉烯酸青霉素族（水解）抗生素类药物的分析专业知识讲座第69页抗生素类药物的分析专业知识讲座第70页2、硫醇汞盐法（1）原理青霉烯酸硫醇汞盐青霉素族HgCl2（咪唑）抗生素类药物的分析专业知识讲座第71页咪唑抗生素类药物的分析专业知识讲座第72页（2）方法对照品法计算pH9抗生素类药物的分析专业知识讲座第73页（3）注意

侧链有-NH2时，需加醋酐先将其乙酰化后才能发生上述反应抗生素类药物的分析专业知识讲座第74页pH9抗生素类药物的分析专业知识讲座第75页3、羟肟酸比色法Fe3+/3H+红色NaOHHClNOH·H2-b内酰胺类羟肟酸衍生物抗生素类药物的分析专业知识讲座第76页HPLC法（四）ChP

内标法＋校正因子外标法特点快速、高效、灵敏专属性强、重现性好

一法多用（判别、检验、含测）Return抗生素类药物的分析专业知识讲座第77页第三节氨基糖苷类抗生素链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素抗生素类药物的分析专业知识讲座第78页链霉素链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺

苷元糖链霉双糖胺抗生素类药物的分析专业知识讲座第79页链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺抗生素类药物的分析专业知识讲座第80页链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺抗生素类药物的分析专业知识讲座第81页巴龙霉素D-葡萄糖胺+脱氧链霉胺+D-核糖+巴龙霉糖巴龙胺苷元巴龙二糖胺

糖抗生素类药物的分析专业知识讲座第82页D-葡萄糖胺脱氧链霉胺D-核糖巴龙霉糖抗生素类药物的分析专业知识讲座第83页庆大霉素

糖苷元绛红糖胺+脱氧链霉胺+加洛糖胺

糖抗生素类药物的分析专业知识讲座第84页绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺抗生素类药物的分析专业知识讲座第85页绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺抗生素类药物的分析专业知识讲座第86页庆大霉素C复合物庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3庆大霉素C2R=R2=H

R1=CH3庆大霉素C1aR、R1、R2=H庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H

庆大霉素C2bR=R1=HR2=CH3抗生素类药物的分析专业知识讲座第87页链霉素坂口反应麦芽酚反应UV3个碱性中心链霉胍链霉糖抗生素类药物的分析专业知识讲座第88页庆大霉素（庆大霉素C复合物）5个碱性中心抗生素类药物的分析专业知识讲座第89页一、结构与性质多与硫酸成盐链霉素

3个庆大霉素5个碱性中心碱性（一）水溶性溶解性（二）抗生素类药物的分析专业知识讲座第90页链霉素pH5～7.5庆大霉素pH2～12稳定稳定性（四）UV（三）抗生素类药物的分析专业知识讲座第91页坂口反应N-甲基葡萄糖胺反应麦芽酚反应抗生素类药物的分析专业知识讲座第92页二、判别

茚三酮反应（一）△羟基胺结构a-氨基酸抗生素类药物的分析专业知识讲座第93页

Molisch试验（二）氨基糖苷类H+糠醛羟甲基糠醛-萘酚蒽酮呈色抗生素类药物的分析专业知识讲座第94页红紫色抗生素类药物的分析专业知识讲座第95页N-甲基葡萄糖胺反应（三）甲基葡萄糖胺巴龙霉素链霉素水解-N乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色（Elson-Morgan反应）庆大霉素抗生素类药物的分析专业知识讲座第96页(缩合)抗生素类药物的分析专业知识讲座第97页红色对二甲氨基苯甲醛H+抗生素类药物的分析专业知识讲座第98页

麦芽酚反应（四）

链霉素特征反应H+分子重排抗生素类药物的分析专业知识讲座第99页紫红麦芽酚抗生素类药物的分析专业知识讲座第100页链霉胍特有反应（或α-萘酚）8-羟基喹啉坂口反应（五）α-萘酚抗生素类药物的分析专业知识讲座第101页抗生素类药物的分析专业知识讲座第102页（六）反应H+UV法（七）庆大霉素无UV吸收nmmax230=l链霉素抗生素类药物的分析专业知识讲座第103页（八）色谱法（1）TLC法：硫酸庆大霉素判别

点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色

对照液

判断：供试液与对照液所显斑点颜色与位置应一致。

点样：供试液

对照液①：硫酸链霉素标准品

对照液②：硫酸链霉素标准品+硫酸新霉素标准品+硫酸卡那霉素标准品

抗生素类药物的分析专业知识讲座第104页判定法：供试液中主斑点位置、颜色、大小应与对照液①相同，

对照液②应显示分离清楚3个斑点不然试验无效。

（2）HPLC法：硫酸庆大霉素判别

比较供试液与对照液各组分保留时间。抗生素类药物的分析专业知识讲座第105页三、特殊杂质检验链霉素杂质（一）链霉素B（甘露糖链霉素）

方法TLC中对照品法（BP）1.起源反应中间体抗生素类药物的分析专业知识讲座第106页对微生物活性无显著差异毒副作用和耐药性不一样发酵菌种不一样工艺差异C组分百分比不一致要求控制各组分相对百分含量ChPUSPBPJP庆大霉素C组分测定（二）抗生素类药物的分析专业知识讲座第107页++410.pH吲哚衍生物巯基醋酸邻苯二醛氨基λmax=330nm衍生化原理

1.抗生素类药物的分析专业知识讲座第108页1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物抗生素类药物的分析专业知识讲座第109页RP－HPLC方法2.要求C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%计算3.峰面积归一化法抗生素类药物的分析专业知识讲座第110页抗生素类药物的分析专业知识讲座第111页四、含量测定微生物检定法各国药典主要采取HPLC法惯用于体内分析Return抗生素类药物的分析专业知识讲座第112页抗生素类药物的分析专业知识讲座第113页第四节四环素类抗生素ABCD抗生素类药物的分析专业知识讲座第114页123456789101112抗生素类药物的分析专业知识讲座第115页四环素（TC）tetracycline抗生素类药物的分析专业知识讲座第116页金霉素

(CTC)

chlortetracycline氯四环素抗生素类药物的分析专业知识讲座第117页土霉素

(OTC)

oxytetracycline氧四环素抗生素类药物的分析专业知识讲座第118页多西环素

(DOXC)doxycycline脱氧土霉素抗生素类药物的分析专业知识讲座第119页美他环素（METC）metacycline抗生素类药物的分析专业知识讲座第120页抗生素类药物的分析专业知识讲座第121页一、结构与性质两性（一）1.与酸、碱均能成盐2.强酸或强碱中溶解度↑

酚羟基、烯醇型羟基

弱酸性二甲胺基弱碱性抗生素类药物的分析专业知识讲座第122页与金属离子生成有色配位化合物Ca2+Mg2+Fe3+Al3+

UV和荧光性质（三）与金属离子络合（四）pH3~7.5荧光

（二）旋光性抗生素类药物的分析专业知识讲座第123页抗生素类药物的分析专业知识讲座第124页不稳定性（五）1.差向异构化差向金霉素差向四环素金霉素四环素～-4-462pH淡黄→黑蓝色荧光抗生素类药物的分析专业知识讲座第125页差向四环素抗生素类药物的分析专业知识讲座第126页（土霉素、多西环素不易差向异构化）抗生素类药物的分析专业知识讲座第127页2.降解反应（1）酸性下降解λmax=445nmλmax=435nm橙黄色脱水金霉素脱水四环素金霉素四环素＜2pH抗生素类药物的分析专业知识讲座第128页脱水四环素抗生素类药物的分析专业知识讲座第129页～～TCETCATCEATC＜＜抗生素类药物的分析专业知识讲座第130页（2）碱性下降解异四环素四环素-OH抗生素类药物的分析专业知识讲座第131页二、判别试验浓H2SO4反应（一）黄色朱红色绿蓝深紫色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素42SOH盐酸美他环素橙红色加水金黄、棕黄黄抗生素类药物的分析专业知识讲座第132页FeCl3反应（二）褐色橙褐色深褐色红棕色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素3FeCl酚羟基抗生素类药物的分析专业知识讲座第133页TLC法（三）盐酸土霉素判别HPLC法（五）EDTA

克服痕量金属造成拖尾现象比较保留时间抗生素类药物的分析专业知识讲座第134页三、特殊杂质检验·4-差向四环素（ETC）

·脱水四环素（ATC）·差向脱水四环素（EATC）·盐酸金霉素（CTC）

相关物质（一）HPLC法（版）盐酸四环素抗生素类药物的分析专业知识讲座第135页四环素相关物质TLC图I.供试液(5mg/ml)ETC(0.2mg/ml)ATC(0.025mg/ml)IV.EATC(0.025mg/ml)CTC(0.1mg/ml)VI.混合液4％0.5％0.5％2％抗生素类药物的分析专业知识讲座第136页吸收度（二）nmmax355268l、盐酸四环素抗生素类药物的分析专业知识讲座第137页杂质吸收度取供试品配成每毫升10mg/ml溶液至4cm吸收池中，在530nm处测定，其吸收度不得超出0.12。应严格控制温度和时间抗生素类药物的分析专业知识讲座第138页四、含量测定HPLC法盐酸四环素测定

系统适用性试验：盐酸四环素、相关物质及ATC峰间

分离度均应符合要求。

定量方法：外标法以峰面积计