北京地区核桃黑斑病病原菌的分离、致病性测定和16SrDNA序列分析

北京地区核桃黑斑病病原菌的分离、致病性测定和16SrDNA序列分析一、背景与目的核桃黑斑病是一种由真菌引起的病害，是严重危害核桃产业的重要病害之一。该病的致病菌主要为水生真菌，属于镰刀菌科。在我国北方地区，自上世纪80年代以来，核桃黑斑病在产区发生范围逐渐扩大，病情加重严重影响核桃的品质和数量，因此对该病害的防治研究具有重要的现实意义。本研究旨在分离并鉴定引起北京地区核桃黑斑病的致病菌，并对分离得到的菌株进行致病性测定和16SrDNA序列分析，为深入研究核桃黑斑病的发生规律和防治提供科学依据。二、材料与方法2.1材料从北京地区核桃树林中采集到病变组织样本，将样本分别置于铝箔袋中，标明采样地点、时间及病势等信息，运回实验室，先在表面擦洗去除细菌和真菌后，然后在无菌条件下划取样本，接种于PDA、V8和水培培养基上。2.2方法2.2.1致病性测定采用组织接种法进行致病性测定。将培养良好的菌丝切碎，接种在核桃嫩叶片表面，每个处理重复3次。对照组插入与核桃剥壳劈开的切口处。接种后所有植株置于恒温恒湿条件下，24小时后拍摄叶片照片，并观察叶片是否出现黑斑。2.2.2分离与鉴定将采集到的病变组织切割成小片，接种于PDA培养基上，培养在28℃的恒温培养箱中，观察和记录菌落性状，筛选出单菌落进行传代培养。根据形态特征，利用光学显微镜和扫描电镜观察和记录菌丝、分生孢子和菌落特征。进行生理生化鉴定和16SrDNA序列分析。2.2.316SrDNA序列分析将菌株进行测序，使用BLAST（NCBI）数据库进行同源性比对，选择最优的25个序列进行群体进化分析。三、结果3.1致病性测定通过组织接种法验证，将筛选出的十个真菌菌株重新与核桃进行接种，其中7个真菌菌株引起了核桃叶片出现片状黑斑，黑斑病情程度各异；而另外3个纯菌株和空白对照均未引起核桃叶片出现黑斑（如图1）。3.2.分离与鉴定从不同样品中分离到10个真菌菌株，实验室培养出菌落规则、菌株表面滑润，分生孢子成串状或分离排列的真菌菌株。通过形态特征和16SrDNA序列比对，鉴定得到了致病菌株为水生菌属Byssochlamysscribula。3.3.16SrDNA序列分析将菌落使用测序技术对16SrDNA序列进行测定，得到一个约1500bp的DNA序列，BLAST检索发现该序列高度同源于水生菌属Byssochlamysscribula中的一个亚种。进一步进行比对分析，发现该序列与该种的同源性达到99.7%以上，因此确认为水生菌属Byssochlamysscribula。四、讨论核桃黑斑病的有效防治需要深入研究其病原菌，并探究其发生规律和防治措施。本研究从北京地区采集到核桃黑斑病样本，通过分离纯化和致病性测定，最终鉴定出致病菌为水生菌属Byssochlamysscribula，证明其为核桃黑斑病的主要病原菌之一。通过16SrDNA序列分析发现其同源性极高，已在国外相关文献中报道该病原菌的序列，因此可以进行序列比对和系统进化分析，推断其物种和种间关系，为探究核桃黑斑病的防治机理和研究提供了理论依据。五、结论经过对北京地区核桃黑斑病病原菌的分离、致病性测定和16SrDNA序列分析，证明水