实验四氨基酸纸层析

实验四氨基酸纸层析第1页，共26页，2023年，2月20日，星期六一、实验目的１、本实验采用纸色谱对几种氨基酸进行分离和鉴定,以了解纸色谱的原理，练习其操作方法。

2、了解测定折光率的简单原理，掌握阿贝折射仪的使用方法。第2页，共26页，2023年，2月20日，星期六

二、实验原理1、色谱分析法（简称色谱法或层析法）色谱分析法简称色谱法或层析法。1906年，俄国植物学家Tsweet将CaCO3放在竖立的玻璃柱中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗。在柱的不同部位形成色带，因而命名为色谱。管内填充物称为固定相，冲洗剂称为流动相。色谱法就是利用混合物中各组分在固定相和移动相中进行反复的吸附或分配作用，达到各组分分开的目的。

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分类:(1)按照被分离物质在固定相中的作用原理不同，色谱法可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱等。(2)按照操作方式不同，又可分为柱色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱、和高效液相色谱等。第4页，共26页，2023年，2月20日，星期六

纸色谱为分配色谱，色谱过程在固定相构成的平面状层下进行。滤纸为载体，固定相为滤纸上的水，流动相（展开剂）为用水饱和过的有机溶剂。纸色谱属于分配色谱。衡量物质向上移动的物理量是比移值（Rf）第5页，共26页，2023年，2月20日，星期六例:大黄中游离蒽醌的纸色谱图溶剂前沿大黄素甲醚芦荟大黄素大黄素大黄酸点样点第6页，共26页，2023年，2月20日，星期六

２、化合物的折光率

折光率象沸点一样，是液体有机物最重要的物理常数之一。衡量液体有机物纯度的标准，折光率比沸点更可靠。利用折光率不仅可鉴定未知物，且可确定沸点和结构相似的液体混合物的组成。

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液体的折光率不但与结构和入射光的波长有关，而且也受温度、压力等因素的影响。由于大气的变化对折光率的测定影响并不显著，所以，通常表示折光率时只标明入射光线的波长和测定时的温度。例如，在入射光为钠的黄光(波长为589.3nm)，测定温度为20℃时，水的折光率为1.3330，表示为=

1．3330。这里n代表折光率，20代表测定时的温度，D代表钠光。

折光率可以通过折光仪精确地测定出来，常用的是阿贝(Abble)折射仪。第8页，共26页，2023年，2月20日，星期六

阿贝折射仪基本原理

在一定的外界(如温度、压力等)条件下，波长一定的单色光从介质A斜射入介质B时，要发生折射现象。其入射角α与折射β的正弦之比是一个常数，并且与这两个介质的折射率nA(介质A)、nB(介质B)成反比。即：根据折射定律可得：

当则所以(折射角的最大值，称为临界角)

时sin0=1

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在临界角以内的区域都有光线通过,是明亮的，在临界角以外的区域没有光线通过，是暗的。在临界角上正好是“半明半暗”（如图4-2所示）。目镜上有一个十字交叉线，若十字交叉线与明暗分界线重合，就表示光线由被测液体进入棱镜时的入射角正好为90。

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由于,棱镜的折光率nB是常数，各种液体的折光率不同，临界角也不同。通过测定临界角的相对位置，经过换算就可以找出液体的折光率，阿贝折光仪的刻度是经过换算后的折光率的读数，故可直接读出折光率。第11页，共26页，2023年，2月20日，星期六

阿贝(Abbe)折光仪

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阿贝(Abbe)折光仪

阿贝（Abbe）折光仪的结构如图。它的主要组成部分是两块直角棱镜组成的棱镜组，上面一块是表面光滑的测量棱镜，下面一块是表面磨砂的可以开启的辅助棱镜。左面的镜筒是读数镜筒，内有刻度盘，其上面有两行数值。右边一行是折射率数值（1.3000～1.7000），左边一行是工业上测量溶液浓度的标度（0～95%）。右面的镜筒是测量目镜，用来观察折光情况。筒内装有消色散棱镜。光线由反射镜射入辅助棱镜，发生漫射，以不同人射角射入液层，然后再射到测量棱镜的表面上。此时一部分光线经折射后进入测量目镜，另一部分光线则发生全反射。调节螺旋，以使测量目镜中的视野半明半暗。第13页，共26页，2023年，2月20日，星期六

三、实验步骤（一）纸层析1．在滤纸条上端边缘约1厘米的中央剪一小孔。2．将滤纸条平放于洁净的纸上，在距离滤纸下端1cm处用铅笔轻画一横线，并在横线的中央画一直径为2mm的小圆圈。3．用毛细管吸取氨基酸混合液，在滤纸条下端的小圆圈内点样。第14页，共26页，2023年，2月20日，星期六

4.取干燥大试管，加入被水饱和的酚溶液10ml，注意勿使溶液沾到试管壁上，将试管垂直固定于铁架台上。5.在距滤纸条下端0.5cm处穿大头针。从滤纸条上端小孔处穿棉线并左右分开，调节线的高度使滤纸垂直悬于试管内且下湍浸入溶液0.5cm，注意勿使点样点浸入溶液中，亦勿使滤纸条接触试管壁。6.此时即可看到溶剂向上移动，溶剂升到一定高度时，小心将纸条取出，以铅笔标出溶剂上升的前沿。第15页，共26页，2023年，2月20日，星期六

7.将滤纸条两端，用大头针钉在小木框上，吹干后用喷雾器均匀地喷一层0.2%茚三酮乙醇溶液，然后再将滤纸条吹干，即可看到纸上显出三色点，每个色点代表一种氨基酸。8.分别测量并计算三种氨基酸的Rf，再根据教师供给的值确定此三个色点各为何种氨基酸。9.留在试管内的酚溶剂切勿弃去，塞紧塞子。氨基酸

Rf值蛋氨酸

0.84丙氨酸

0.62谷氨酸

0.32第16页，共26页，2023年，2月20日，星期六

（二）折光率的测定1、折光仪读数的校正

（1）将阿贝折光仪置于普通白炽灯前或靠近窗户的桌子上。但不要放在直射的阳光下，以免液体试样迅速蒸发。将温度计插人金属匣中，然后接道恒温水，恒温20min左右。恒温温度可以从温度计中读出。（2）旋开棱镜锁紧扳手，开启铺助棱镜，用按镜纸蘸少量乙酸（或丙酮）轻轻揩拭镜面。待镜面干燥后，滴加1～2滴蒸馏水于辅助棱镜面上，旋紧棱镜锁紧扳手，使蒸馏水均匀地充满视场，注意不要有气泡。

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（3）调节反光镜，使从测量目镜中观察到的视场最亮。调节目镜，使聚焦于“十”字的支点上。调整消色散棱镜手轮，使视场中呈现黑白分界线。转动棱镜转动手轮，使黑白分界线恰与“十”字的交点重合。（4）记下蒸馏水的折光率，重复操作2～3次，与标准值比较，得到零点的校正值。第18页，共26页，2023年，2月20日，星期六

2、加样

打开棱镜，用擦镜纸(必要时用丝绢沾少量乙醇或丙酮)轻轻擦洗上下镜面，要单向擦，不要来回擦。待溶剂挥发后，滴1～2滴待测液体于磨砂棱镜面上,小心地关闭棱镜，使液体铺满整个镜面。3、对光

调节反光镜使入射光达到最强，目镜内视场明亮，轻轻转动棱镜调节旋钮，直到在望远镜内观察到明暗分界线或彩色光带。第19页，共26页，2023年，2月20日，星期六4、消色

转动棱镜微调旋纽（消色散）至看到一个黑白明晰的分界线,如图所示.转动棱镜调节旋钮使分界线对准十字交叉线的中心。

5、精调第20页，共26页，2023年，2月20日，星期六

6、读数

从镜筒读出折光率（位于下面的刻度）并记下测定时的温度,重复2～3次．7、清洗

测好样品后，用擦镜纸轻轻擦去上下镜面上的液体，再用乙醇或丙酮润湿的擦镜纸单向擦上下镜面，待棱镜干后，旋紧锁钮.

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1．层析缸要预先饱和，展开剂勿附着于大试管内壁。2．点样量要适当，太少效果不明显，太多分离不好。要求点的样直径不超过０.５ｃｍ。３．无论在准备工作中还是以后的实验过程中，都不要用手触摸纸条中部，因为手上不干净物或皮屑落在纸上会产生多余斑点而干扰实验结果．4．样品点不能浸入展开剂中。注意：

第22页，共26页，2023年，2月20日，星期六5．Abbe折光仪使用前,必须用重蒸馏水(=1.3330)或标准折光玻璃块校正.每次测定前、后都必需用1～2滴丙酮或乙醇滴于棱镜面上，合上棱镜，使上下镜面全部被丙酮润湿再打开棱镜，然后用擦镜纸擦干丙酮。6．严禁腐蚀性液体、强酸、强碱、氟化物等的使用。7．阿贝折射仪的关键部位是棱镜，必须注意保护。滴加液体时，滴管的末端切不可触及棱镜，擦洗棱镜时要单向擦，不要来回擦，以免在镜面上造成痕迹。在每次滴加样品前应洗净镜面，测完样品后也要用丙酮或95％乙醇擦洗镜面，待晾干后再关闭棱镜。

第23页，共26页，2023年，2月20日，星期六8．阿贝折射仪的量程为1．3000一1．7000，精密度为土0．0001，通常用四位有效数字进行记录。测量温度应控制在±0．1℃范围内。9．阿贝折射仪不能在较高温度下使用。第24