细胞生物学实验教程：细胞运动性检测实验详细介绍

/细胞运动性概述细胞的运动是机体新陈代谢与基本生命特征之一。在低等生物中，原始细胞通过变形和伪足活动趋近食物和远离伤害。在高级生物体的生命活动中,细胞的定向迁移与胚胎形成、神经发育、免疫应答、器官成熟等密切相关。人类的许多重大疾病及其治疗，如肿瘤转移，神经修复、干细胞功能再生等等都与细胞运动息息相关。细胞的运动依赖于细胞骨架（Ｃｙｔoskeleｔon)，细胞骨架除了承担胞内的物质运输之外，也是构成细胞运动性的物质基础，例如肌动蛋白是细胞运动伪足中最主要的结构单位。当细胞感受到外界的刺激信息（如食物信号等）,会伸出扁平的片层伪足，通过其前沿的不断延展和基部的收缩,以及细胞与支撑物之间的吸附、解吸附的动态循环,朝向刺激源运动。细胞的运动还具有粘附性（Adhｅｓiｏｎ）与趋向性（Polarｉzaｔｉｏｎ）的特点，不同的粘附因子与细胞外基质(ExtracｅllｕlarＭatrix）相互作用一方面决定了细胞运动的分子信号调控，同时与大量的趋化因子共同决定了不同细胞的特定组织转移与偏好。图1：细胞的定向迁移运动图2：细胞的运动性与细胞骨架蛋白图3:神经干细胞分化与神经元的定向迁移图4:原生癌细胞的迁移与侵袭图５:一个正在穿孔的肿瘤细胞的运动图6：恶性黑色素瘤细胞侵入机体正常组织图7：上皮细胞在伤口部位增殖，运动迁移,进行组织修复细胞运动性常用检测方法细胞运动性研究在发育生物学、神经生物学、癌症与干细胞生物学等诸多前沿科学领域具有重大研究意义.然而长期以来细胞运动性检测是一个技术难点，目前常规可用于细胞运动性评估的主要方法有：基于显微镜的形态观察（含荧光标记）、体外组织移植、细胞集落划痕和BｏydenChaｍｂer法,这些方法各有千秋，但都无法实现定量检测细胞定向迁移、癌细胞侵袭性以及细胞粘附性等，最近罗氏公司推出的基于BoyｄenChａmber原理的微电子细胞芯片检测技术（xCELLｉgence)实现了定量、动态、无标记对于大规模细胞迁移、侵袭、粘附性的检测，同时还可同步检测包括细胞增殖、凋亡等多项细胞生理学功能.基于显微镜的形态观察(可免疫荧光标记)基于显微镜直接观察细胞运动性一般依赖活细胞工作站记录单一细胞的运动轨迹,如果通过染色标记可以观察细胞骨架的改变。该方案对显微系统要求高,难以同步观察细胞群落的整体状态，染色侵入式标记对细胞损伤大.活细胞工作站观察非小细胞共聚焦显微镜观察绿色荧光标记运动中的细胞肺癌（Ａ549)的体外运动体外组织移植（可免疫荧光标记）通过原代组织，建立短期的移植物离体培养，经染色可直接观察迁移能力。适用于少数特定组织如神经元，应用范围有限，技术难度大。小鼠嗅球神经干细胞体外移植物迁移小鼠海马神经干细胞体外移植物定向迁移（无趋化因子诱导）（SＤF—1趋化因子定向诱导）细胞集落划痕建立细胞培养划痕实验，观察人为划痕的愈合状态来间接评估细胞迁移率，实验简单，但误差大，重复性低，干扰因素多。细胞伤痕愈合试验单细胞层刮出条状“伤口”０小时，18小时后，细胞层的愈合状况。Ｉ：诱导表达14-3-3蛋白的3Ｔ3细胞;U:未诱导表达1４—ＢoyｄenCｈaｍｂer法BoydeｎChａmbeｒ法又称Ｔranswelｌ技术，是目前最常用的检测细胞运动性方法，通过将细胞加入上孔室,在下孔室加入血清或其它趋化因子诱导细胞迁移到下室。利用染色人工计数迁移细胞数目用于评估细胞的迁移.该方法无法满足动态同步监控，人为计数误差较大,重复率低。显微镜观察迁移到微孔膜底部的细胞（染色后）基于BoyｄenChamber原理的微电子细胞芯片检测技术(ｘＣELLｉｇenｃe—ＲTＣIＭ）xCＥＬLiｇence-ＲＴCIＭ是Ｒoche与ＡcｅaBｉo公司联合开发出来最新一代细胞检测技术，将微电子传感技术与BoydenＣhambeｒ原理相结合,将电子芯片植入上孔底部膜表面，从而实现了动态、非标记的实时监控细胞迁移.同理在上孔基部膜上侧包被不同的基质层，可用于检测癌细胞侵袭。该xCELLigeｎce包含６Ｘ１6的检测孔，可同步检测多达96组样品，与xCELLigenc-RTCES系统结合还可同步检测细胞增殖、凋亡等多项细胞生理学指标。AＢC图:xCELLigence(RＴ－ＣIM）对非小细胞肺癌细胞株Ａ549迁移运动的实时监测A:用于检测细胞迁移与侵袭的实时细胞分析系统xＣＥLLigｅncｅ(ＲT—CIM)Ｂ：基于BoydenChaｍber原理的整合细胞阻抗传感技术的检测板。上室板中的细胞向含趋化因子的下室板定向迁移过程中,内置的阻抗传感器实时纪录细胞的运动过程。C：A549细胞的细胞迁移动态曲线绿色:无血清诱导对照；红色:血清成分诱导对照组表:几种细胞运动检测方法的比较运动形态观察体外组织移植划痕法BoydｅnChaｍberxCELＬigeｎce检测原理显微观察组织移植、显微观察伤痕愈合细胞穿孔迁移细胞穿孔迁移微电子传感检测标记染色可染色观察需染色观察无需染色观察无检测细胞数目单一或少数细胞集落细胞集落细胞集落细胞群落(数量可控）特点定性研究，多静态观察动态观察需活细胞工作站简单定量误差大实验繁琐组织采集技术要求高方法简易误差大方法简易误差大全自动实时监控动态观察非标记、非侵入式检测重复性高人为干扰小细胞微电子芯片检测技术(xCELＬIigｅｎce）原理简述xCELLigeｎce细胞实时分析系统是基于检测电子传感器阻抗变化以反映细胞生理状态的新型细胞分析系统,其系统的核心是把微电子细胞传感器芯片整合到表面适于细胞贴附与生长的细胞检测板的底部或细胞浸润迁移板的微孔膜。微电子芯片测定的电阻抗即反映了细胞生长、伸展、形态变化、死亡和贴壁程度等一系列生理状态。图：基于电子阻抗原理的高通量细胞芯片技术示意图Ａ:细胞检测板底部的微电子细胞传感器用于检测阻抗变化B：基线阻抗纪录了检测板加入细胞之前的状况C:阻抗的变化放映了细胞生长、增殖、迁移等生理状态细胞指数(CI)）是基于阻抗和细胞状态（包括贴壁细胞数量和贴壁状态)之间的对应关系，转化的一个指数参数，用以定量和比较细胞的真实状态。ＣI值具有以下几个特点：当不存在细胞或者细胞没有很好贴壁在电极上，细胞指数为零。在相同的生理条件下，贴附在此孔电极表面的细胞越多细胞指数越大。细胞指数可以用来定量检测孔里存在的细胞数量.细胞状态的变化，比如细胞形态,细胞贴附或者细胞生长都会导致细胞指数的变化。基于微电子阻抗传感技术的xCELLiｇence细胞实时分析系统具有免标记、实时、定量、自动化等诸多优势。具体表现为:高信息量：可连续检测生物反应的全过程,提供大量重要的动态反应信息。无标记:分析无需昂贵的标记或报告。无创伤:电子检测不会干扰细胞生长和分析。高准确度和精确度：定量衡量细胞生长，提供高于2个数量级的动态范围，孔对孔ＣV通常低于５％。自动实时检测：整个实验过程自动收集数据，实时分析,大大改善仅仅在最终点分析的结果。灵活性:独特的设计允许自定义分析项目，提高实验室的效率。易操作：用户友好的软件，简单直接的安装，简化培训和操作.系统整合：微孔感应设备可与已有的滴定板设备配套使用。活细胞品质控制：在培养孔中检测细胞质量。ｘＣELLiｇｅnce细胞实时分析系统包括RＴ－CIM™和RT－ＣEＳ®两个系列：细胞迁移与侵袭性监控分析系统，动态细胞高通量功能检测系统细胞迁移与侵袭性监控分析系统ｘCELLIigｅnce／RT-ＣIMxCELLIigｅｎce/RT-CIM的检测板由上室板和下室板组成。上室板微孔底部具微孔膜，其下表面整合了微电子生物传感器。下室板则作为细胞培养基的容器。当上室板中的细胞通过微孔发生迁移时就可被生物传感器检测到。通过系统测量的阻抗得到的指数，反映迁移细胞的数量.图：装配一体的上室板和下室板以及上、下室之间的带电极的微孔（8um)膜动态细胞高通量功能检测系统xCEＬＬIｉgｅnｃe／RT－CES图：动态细胞高通量功能检测系统的检测板:１６孔板，96孔板以及微孔底部金电极ｘCELＬＩｉgence应用领域与已发表论文目录细胞侵袭和迁移细胞增殖细胞质控化合物介导的细胞毒性细胞介导的细胞毒性细胞贴壁和伸展受体介导的信号传导功能性监测GPCR信号的功能监测IgE受体功能屏障功能病毒定量已发表的参考论文（略）应用实例乳腺癌细胞株（MCＦ７）的迁移力动力学检测乳腺癌细胞株（MCF7)上室孔含５000个细胞/孔,无血清饥饿6小时,下室孔含１0％血清。某种趋化因子不同的浓度梯度对破骨细胞迁移的影响上室孔含成骨细胞１000０个细胞/孔；底部微孔膜包被2小时，下室孔培养液含不同浓度的ＢMP趋化因子，无血清诱导。小鼠某种肿瘤细胞迁移能力Conｔrol为野生型小鼠乳腺肿瘤细胞；Mｕtaｎt为某基因敲除缺陷型乳腺肿瘤细胞上室孔含乳腺肿瘤100０0个细胞／孔;底部微孔膜Fibｒoneｃtin包被２小时，下室孔培养液含不同浓度的BMP趋化因子,无血清诱导。某种细胞的分化功能检测Contrｏl为野生型小鼠神经干细胞;Mutanｔ为某基因敲除缺陷型神经干细胞检测芯片预先PDL+Ｌaminin双层包被处理，神经元分化2４小时后加入２%血清诱导胶质细胞分化。某抗肿瘤药物抑制乳腺癌细胞（MCF７）的动力学分析低，中，高三种浓度长春瑞滨（NVB）作用于乳腺癌细胞(ＭCＦ7)的动力学效应。细胞增殖的动力学图谱指导天然药物活性成分分离的运用AnionicAnionicfractionNon-polarcationicfractionAnion-exchangecolumnANon-polar,cation(DEAEchromatography)lower3Kd(Superfiltration)HerbC.S.DAnionicfractionSerum-freefraction(DEAEchromatography)BCOver3KdfractionSerum-freefraction(Superfiltration)A：某天然药物经阴离子交换柱分离获得的非极性,阳离子混合组分与阴离子组;Ｂ,C：阴离子组分(B）与经超滤分离的大于3KD组分（C)均不能呈现特征性细胞指纹图谱；D：非极性，阳离子混合组分与超滤小于3ＫD组分呈现与天然药物类似的特征性“细胞指纹图谱细胞增殖的动力学图谱预测天然药物细胞学功能AABA:前期研究筛选的某天然药材特征性细胞图谱;Ｂ:抗细胞有丝分裂的6种已知小分子化合物呈现的特征性图谱（即该类化合物的细胞功能标识图谱）技术服务服务内容细胞趋化和迁移检测肿瘤细胞迁移和侵袭抗肿瘤转移药物筛选实时动态细胞功能检测(增殖、凋亡、粘附等）天然药物生物活性成份筛选与功能预测与评估试验流程客户提供服务要求与实验预约；与客户沟通后确定试验方案;方案实施与实验操作实验结果分析，提供检测报告。服务价格项目名称ｘCEＬＬIgenｃe检测系统项目内涵计价单位校外单价（元）细胞趋化与迁移动态监测RTCIM细胞迁移监测芯片、试剂和耗材16孔.次3000人工费与数据处理１6孔。次100０仪器占用费板.小时15４000+15＊小时数细胞生理学功能动态检测RTCES细胞生长监测芯片、试剂和耗材16孔.次1５0０人工费与数据处理１６孔．次50０仪器占用费板.小时15２0０0＋15＊小时数备注肿瘤细胞浸润性动态检测另加收芯片预处理费3０0元受检样品与细胞质控要求客户提供测试样品如化合物、趋化因子、生长因子、天然药物等，并不提供测试样品的理化性质,如质量、浓度、分子量、溶解度等。目前可以提供已验证合格用于迁移、侵袭和细胞功能分析的细胞株包括:细胞名称种类A549人非小细胞肺癌株MCＦ７人乳腺癌细胞株Helａ人宫颈癌细胞株ＨＴ108０人纤维肉瘤细胞株ＭＤＡ—MＢ-２３１人乳腺癌细胞株MDA－MB—435Ｓ人乳腺癌细胞株ＨepG2人肝