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多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis

PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。PCR技术体内DNA的复制体系DNA聚合酶（IIIIII）拓扑异构酶解旋酶类SSB

引物dNTPMg2+5’3’PCR技术Mullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段PCR技术Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020耐热DNA聚合酶Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。PCR技术PCR反应循环72℃94℃55℃PCR循环变性退火延伸PCR技术

PCR的指数扩增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火PCR技术TaqP1P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+PCR技术1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。

DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。

PCR反应条件PCR技术（2）引物浓度

0.1-0.5mol/L

浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq

DNA聚合酶

0.5-2.5U/50l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。PCR技术（4）dNTP

dNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。PCR技术（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。

Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。

Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。PCR技术2）循环参数变性

使双链DNA解链为单链

94℃，20-30秒(2)退火

温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。PCR技术（3）延伸

70-75℃,一般为72℃

延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数

主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加PCR技术PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍PCR技术2）特异性引物引物

引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。PCR技术引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。PCR技术3）操作简便易行

利用PCR扩增,只需要数小时,就可以扩增出可用电泳法检出的DNA，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。

PCR技术PCR示例一、实验目的学习PCR分析的原理与技术。PCR技术1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18-T

质粒DNA2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管琼脂糖凝胶电泳设备3、试剂：10XPCR 反应缓冲液

25mmol/LMgCl2

10mmol/LdNTP10μmol/L引物1和引物2二、实验材料、仪器和试剂PCR技术1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀：

10XPCR反应缓冲液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL

10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μL质粒DNA1.0μLTaq0.1μL(5U)水补充至25.0μL三、操作步骤PCR技术2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀：

10XPCR反应缓冲液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL

10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μL质粒DNA1.0μLTaq0.