转录组实战讲解之表达定量和差异与功能分析

转录组实战讲解之表达定量和差异与功能分析第一页，共29页。步骤四：表达值的定量定量策略&工具步骤五：差异分析差异分析工具步骤六：功能注释附录：运行命令第二页，共29页。转录组分析的通用套路定量鉴定差异功能有多少RNARNA的表达量结构、表达量、比例的变化功能注释3第三页，共29页。测序数据和参考基因组比对测序评估及低质量过滤编码基因表达注释转录本重构长非编码鉴定长非编码表达注释编码基因差异(特异)表达GO功能显著性富集Pathway显著性富集功能富集网络图长非编码差异表达GO功能显著性富集Pathway显著性富集功能富集网络图FusionsJunctionsGenomeBrowser可视化转录组第五讲测序中国-测序学堂转录组第三讲转录组第四讲转录组第六讲第四页，共29页。步骤三：转录本的构建（Cufflinks/Scripture）构建流程详解基因存储文件:Gtf,Bed格式文件Cuffmerge/cuffcompare合并转录本转录本构建效果评估多外显子比率、已知覆盖程度步骤四：长非编码RNA的鉴定鉴定流程详解关键:如何判断编码或是非编码基因工具：CNCI，CPC,PhyloCSF上期回顾第五页，共29页。一个测序实例取样：晚期肝癌病人的肝组织(共4个)癌旁组织(N)原发灶(P)转移灶(M)门脉血栓转移灶(V)一组时间序列上的4个点的取样6第六页，共29页。步骤四：表达值的定量定量策略&工具步骤五：差异分析差异分析工具步骤六：功能注释附录：运行命令第七页，共29页。转录组分析的通用套路定量鉴定差异功能有多少RNARNA的表达量结构、表达量、比例的变化功能注释鉴定完成后的分析步骤8第八页，共29页。定量策略FPKMexpectednumberoffragmentsperkilobaseoftranscriptsequencepermillionsbasepairssequencedTPMtranscriptpermillionRPKMreadsperkilobasepermillionmappedreads9第九页，共29页。定量工具：Cufflinks(FPKM)Cuffdiff(FPKM)推荐RSEM(TPM)推荐Range(RPKM)10第十页，共29页。FPKM定量计算工具：cufflinks输出结果transcripts.gtfisoforms.fpkm_trackinggenes.fpkm_tracking转录本定量？基因定量？定量：cufflinks-Gref.gtf–ooutdirtophat_outdir_N/accept_hits.bam第十一页，共29页。长编码RNA表达定量蓝线：长非编码基因黑线：非编码基因NPMV第十二页，共29页。步骤四：表达值的定量定量策略&工具步骤五：差异分析差异分析工具步骤六：功能注释附录：运行命令第十三页，共29页。差异分析差异分析工具：DeseqHypothesistestingH0:nodifferencebetweentowconditions.NegativeBinomialforreadscountCuffdiffTestA.FPKM-B.FPKMwithnormaldistributionSAMseqNonparametricmethodsMann-WhitneystatisticNeedmanysamples/replicatesinconditionsEBseqEmpiricalBayesianmode(forTPM)14第十四页，共29页。Cuffdiff输出结果isoforms_exp.diffgenes_exp.diffsplicing.difftherelativecontributionofdifferentisoformsissignificantlydifferent

tissue1is80/20fortwoisoformsandtissue2is50/50tss.diff第十五页，共29页。表达差异分析结果P/N∪M/N∪V/N=342codinggenesP/N∪M/N∪V/N=312lincRNAgenes第十六页，共29页。动态变化分析(特异性分析)JSscorerangingfrom0to1;Jensen-Shannon(JS)ScoreAperfecttissue-specificpatternwillbescoredasJS=117第十七页，共29页。动态变化分析(特异性)18第十八页，共29页。步骤四：表达值的定量定量策略&工具步骤五：差异分析差异分析工具步骤六：功能注释附录：运行命令第十九页，共29页。功能注释工具：DavidGo(Forcodinggenes)./ncFANs(forlincRNAs)ncfansv2/20第二十页，共29页。DavidGO:数据上传第二十一页，共29页。DavidGO:注释数据库选择GOTERM_BP_FATKEGG_PATHWAY第二十二页，共29页。DavidGO:FunctionalAnnotationClustering第二十三页，共29页。DavidGO:FunctionalAnnotationChart第二十四页，共29页。功能注释25第二十五页，共29页。步骤四：表达值的定量定量策略&工具步骤五：差异分析差异分析工具步骤六：功能注释附录：运行命令第二十六页，共29页。运行命令汇总

差异分析&定量：cuffdiff-ocuffdif