脂肪干细胞614课件

脂肪间充质干细胞Adipose-derivedMesenchymalStemCells汇报提纲研究背景脂肪干细胞优点及表面标记多向分化潜能猪脂肪干细胞分离培养、诱导分化及其建系应用前景及待解决的问题一、研究背景

动物体内，脂肪组织不仅是重要的能量贮存库和赋形组织，还是保持内环境稳定及具有分泌激素和细胞因子的重要部位。脂肪细胞增殖与分化失常是导致肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要因素。因此，脂肪细胞分化的研究一直是国内外医学及生物学领域的研究热点之一。

2001年Zuk等首次从病人脂肪组织悬液中分离获得了有多向分化能力的细胞，并将其命名为抽脂处理细胞（PLA）。PLA在特异性诱导剂下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。之后，多个研究小组相继证实，脂肪组织中确实存在着与骨髓间充质干细胞相似的成体干细胞。脂肪间充质干细胞的发现进一步拓宽了脂肪组织领域的研究。背景知识二、脂肪源间充质干细胞的优点首先，从人类医学角度说，获取脂肪间充质干细胞比骨髓源性干细胞容易的多。皮下脂肪切除术是一种普通的外科手术，其安全性高、对患者带来的痛苦小。即AMSCs具有易获得性、安全、可迅速扩增及多向分化能力等特点，其将成为具有广阔治疗应用前景的一类成体干细胞。

其次，脂肪组织比骨髓中所含干细胞比率大。

通过成纤维细胞集落形成单位比较脂肪组织显示，成人骨髓来源细胞中成纤维细胞集落形成单位出现频率为1/50000～1/1000000，而当脂肪组织用胶原酶消化，除去上层漂浮的成熟脂肪细胞，下层细胞中成纤维细胞集落形成单位的频率为1/100，说明脂肪组织中干细胞数目至少是骨髓的500多倍。脂肪间充质

干细胞优点

关于脂肪间充质干细胞标志，目前尚无统一标准。一般认为，脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均表达CD44、CD105、STRO-1、CD166及CD117。其中CD117是一种干细胞因子受体，在全能或多能干细胞中表达，包括胚胎干细胞。表面标记

除了上述几种标记外，脂肪间充质干细胞也表达其他多种分子标记，包括CD29（β1-整合素，在血管发生治疗中起重要作用）、CD44（透明质酸盐）和CD49e（α5-整合素，在细胞粘附纤连蛋白中起重要作用）等。表面标记

不同研究组对脂肪间充质干细胞表面标记的鉴定结果并不完全一致，如Gronthos等发现AMSCs不表达STRO-1，但Zuk等发现表达STRO-1。这些不一致的结果可能与细胞所处状态及纯度有关。表面标记近几年的研究结果表明，在合适诱导剂下，脂肪间充质干细胞和骨髓干细胞一样，可向脂肪、软骨、成骨、神经元细胞、成肌细胞、血管内皮细胞等方向分化。三、多向分化潜能多向分化潜能StremBM,2005多向分化潜能分化方向相关文献骨骼肌Mizuno,2002；Bacou,2004；陈希平,2004心肌Rangappa,2003；Planat-Benard,2004；Yamada,2006(棕色脂肪组织)；张端珍,2005；王燕,2005成骨Zuk,2001,2002；Halvorsen,2000；Hattori,2004；陈希哲,2004软骨Huang,2004；Winter,2003；严笠,2005脂肪Zuk,2001,2002；Sen,2001；VonHeimburgD,2001神经Safford,2004；Ashjian,2003；Rchman,2004；杨立业,2003,2004细胞类型

诱导物细胞特性脂肪细胞地塞米松,异丁基甲基黄嘌，胰岛素等

细胞中充满脂滴，油红o染色阳性成骨细胞2-磷酸抗坏血酸,β-甘油磷酸，地塞米松等钙化性基质产物，茜素红染色阳性骨骼肌细胞地塞米松，氢化可的松，或5-氮杂胞苷多核形态，骨骼肌肌性素重链/MyoD表达心肌细胞5-氮杂胞苷细胞圆形，α-肌动蛋白和肌钙蛋白-I表达神经元细胞β-巯基乙醇或者异丁基甲基黄嘌,消炎痛等细胞缩小、周围有多个神经突起内皮细胞血管内皮细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子细胞之间形成网格样结构，表达内皮细胞特异性抗原肝(实质)细胞肝细胞生长因子，抑瘤素M表达白蛋白和α-胎蛋白肝实质细胞

在2006年4月第16卷4期的自然科学进展上，裴雪涛等人发表的文章《人脂肪来源的干细胞体外培养特性及分化为肝细胞样细胞的研究》。细胞培养7-8天后，细胞生长即可达80%-90%融合，贴壁细胞紧密排列成漩涡状、网状、辐射状，有一定的方向性，集落大小不一，含数个至数百个细胞不等；集落中细胞形态为典型梭形细胞(图A)，这就是我们所要分离获得的猪AMSCs。原代培养14d左右即可形成致密单层(图B)。BAAMSCs的培养特性CD44+(×50)

CD105+(×100)CD14–(×50)

CD34–(×100)

CD106–(×100)

HLA-DR–(×50)

利用免疫组织化学方法检测猪AMSCs特异性表面标记，结果：CD44和CD105呈阳性。CD14，CD34,CD106,HLA-DR均为阴性。AMSCs的表面标记

在地塞米松、抗坏血酸和β－磷酸甘油钠的诱导作用下，猪脂肪间充质干细胞逐渐由成纤维样的长梭形（对照组，图A）变为成骨样的方块形，细胞堆积呈卵圆形或方形（图B）。AB成骨诱导成骨诱导后的形态学观察

β－actinOCN165bpCOL-1539bp

β－actinRT-PCR检测成骨标志基因COL-1（Ⅰ型骨胶原）及OCN（骨钙素）表达M:marker;1-4分别为第0天，7天，14天，21天OCN的表达;5-8为COL-1的表达。

结果：在成骨诱导分化的早期（第7天），可检测到成骨特异性基因Ⅰ型骨胶原和骨钙素的表达，随着诱导时间的增加，2个基因的表达量呈上升趋势。成骨诱导RT-PCR检测标志基因mRNA的表达

上述结果说明：在合适诱导剂下，猪脂肪间充质干细胞形态和排列均发生变化，成纤维样的长梭形变为成骨样的方块形，细胞堆积呈卵圆形或方形，茜素红染色和RT-PCR均表明可以诱导分化成骨细胞。成骨诱导β-actin399bpMyoD243bp

Myf5

154bp上图是用5-氮杂胞苷诱导1周后的结果，由图可以看出,诱导一周后即可检测到成肌细胞分化早期表达基因Myf5和MyoD的表达。RT-PCR检测成肌标志基因的表达1为对照，2为Myf5(成肌调节因子)，3为MyoD(生肌决定因子)

成肌诱导肌细胞标志基因mRNA的表达成脂诱导后的形态学观察诱导48h(×100)诱导21d(×100)对照21d(×100)脂滴融合(×200)

猪脂肪间充质干细胞经成脂诱导48h后，细胞胞浆内出现个别脂滴(图A)，随着诱导时间的延长,充脂细胞数量增加(图B)，且小脂滴逐渐融合成大脂滴(图C)。对照组细胞无充脂细胞出现（图C）。ACBD成脂诱导油红O染色B诱导后充脂细胞明显增多（×100）

脂滴融合,胞核位于细胞一侧（×200）诱导后的脂肪细胞经油红O染色后,脂滴呈红色成脂诱导脂肪细胞标志基因表达B0260.00.20.40.60.8abcd14PPAR-γmRNA表达丰度诱导天数AMSCs成脂诱导后第2天可以检测到脂肪细胞标志基因PPARγ的表达,且随着诱导时间的增加,其表达水平也增加。PPARγ595bpβ-actin

399bp成脂诱导

由上述结果可以看出，猪脂肪间充质干细胞在地塞米松、胰岛素、吲哚美辛等的诱导作用下，细胞形态发生变化，由长梭形变为充满脂滴的脂肪细胞。油红O染色和RT-PCR均表明可以诱导分化脂肪细胞。成脂诱导

研究表明，脂肪细胞由中胚层间充质干细胞发育而来，近30多年来对脂肪细胞的研究主要使用的是鼠源性前体脂肪细胞系和原代前体脂肪细胞。但是这两者都是已经定向的单能细胞，只能分化为成熟的脂肪细胞，因此这两个体外培养体系的研究只能局限于前体脂肪分化为成熟脂肪细胞这一阶段的细胞和分子事件。猪AMSC细胞系建立的初步研究

因此，AMSCs细胞系的建立可为研究脂肪细胞分化全过程，探讨脂肪细胞分化早期细胞与分子事件提供新的研究模型。本实验室在成功分离猪原代AMSC细胞后，细胞单克隆扩增方法获得单一来源的AMSC细胞，传20代后细胞形态一致，经鉴定仍然具有AMSC表面标志。细胞单克隆扩增培养所有细胞均来源于同一祖细胞，细胞形态一致CD105＋CD44＋24代细胞表面marker鉴定

目前我们正在对保存的细胞进行染色体核型分析，支元体检测等工作。

现有的研究表明，脂肪组织是一个易获取和储量丰富的成体干细胞库。AMSCs取材容易，创伤小，具有可控制的多向分化能力，对于组织工程来说，几乎是个“完美”的细胞；且细胞培养、扩增较容易，易获得大量可供自体或异体移植使用的干细胞；在急、慢性骨、软骨组织损伤，肌组织缺损、矫形手术、中枢神经系统损伤及其它领域有潜在应用价值。五、AMSC应用前景及待解决的问题

但若将该细胞应用于临床，仍需在动物模型上进行大量安全性和有效性的实验。尽管AMSCs实际应用过程中仍存在一些需要解决的问题，如体外培养是一种优化过的环境，而体外培养后的AMSCs能否适应体内环境而继续生长分化；在体内AMSCs分化控制过程中能否排除致瘤性风险及是否发生免疫紊乱等。

另外，种子细胞最终移入体内还需有合适的生物材料作载体，这种载体必须具有生物相容性，并可生物降解，易于生长因子等促细胞分化和组织形成的分子物质的连接和输送，易于生产和使用。目前关于生物载体的研究相对较少，因此，特异性组织生物材料也将是一个重要而广阔的研究领域。但相信有关AMSCs的研究仍然前景广阔，脂肪组织来源的AMSCs未来极有可能会取代目前的干细胞源而成为组织工程、基因治疗的一个新的热点，并能解决一系列临床难题而具有良好的应用前景。

鉴于脂肪源性干细胞强大的“可塑性”、容易获得、免疫排斥小等优点，国外一些公司和研究机构等纷纷谋求脂肪间充质干细胞成为组织工程或细胞治疗新的同种异体种子细胞来源，并申请了相关专利。

2004年12月16日MacroPoreBiosurgery公司（法兰克福）与Giessen大学联合对外公布使用脂肪间充质干细胞治疗一名七岁女孩颅骨缺损的临床报告，为该领域今后的工作奠定了基石。通过对欧洲专利局世界专利数据库检索，2005年1月5日前已经公开的关于脂肪源性干细胞的基本专利共有14项，显示出脂肪间充质干细胞潜在的市场价值。

专利号及相关专利专利名称EP1453954

US2003124721，WO03039489

脂肪干细胞分化成内分泌胰腺及其用途US2003166278

US6555374、CA2316400

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