T细胞表型及脾细胞分离课件

研究生实验一、T细胞表型测定（一）二、小鼠脾细胞分离技术邸大林Tel：2608468Email：实验一、T细胞表型测定（一）

---免疫细胞的分离、细胞涂片、固定及保存原理：

T细胞是一个复杂的，不均一的整体，根据其发育的不同阶段，表面标记以及功能，可将其分为不同的亚群。T细胞介导细胞免疫应答，并且对B细胞介导的体液免疫应答起到辅助和调节作用。正常值：正常人外周血中：

CD3为60%～80%；CD4为35%～55%；CD8为20%～30%CD4/CD8的正常值约1.4～2.0。CD4／CD8＜1.4：①免疫缺陷病，如艾滋病的比值常小于0.5；②恶性肿瘤；③再生障碍性贫血；④某些病毒感染。CD4／CD8＞2.0：自身免疫性疾病，如SLE、类风湿关节炎等。T淋巴细胞表面标志的检测，有助于了解机体的细胞免疫功能，对免疫缺陷病、肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、移植排斥反应等疾病的诊断、分型、预后和疗效观察有着重要的意义。Tcell待测T细胞CD分子（？？？）一抗二抗底物实验基本流程实验材料肝素、淋巴细胞分层液、Hank’s液、PBS等；一次性注射器、试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜，温箱等。鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体（1抗）；羊抗鼠IgG（生物素化2抗）；SABC-AP；底物（BCIP/NBT磷酸甲苯胺蓝盐）等。标本制备：淋巴细胞悬液的制备（1）取肝素抗凝血5ml与5mlHank’s液稀释混匀，每组取2ml，用滴管贴管壁轻轻叠加于2ml分离液上，配平后1500rpm离心10mins。（2）洗涤细胞：用滴管仔细吸出位于血浆和分离液之间乳白色的淋巴细胞，放入盛有2mlHank’s液的试管，1500rpm离心10mins，弃上清，将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank’s液重复洗涤一次，最后一次用PBS洗涤。（3）弃去上清，淋巴细胞沉淀用200μlPBS溶解，取20μl细胞涂片，下一次实验检测T细胞亚群用。标本染色细胞涂片用记号笔划圈，滴固定液1滴，室温固定2～3分钟。滴加鼠抗人CD3、CD4、CD8抗体15μL，轻轻摇晃，使单抗均匀铺在细胞表面，37℃孵育2～3h，PBS洗3次。滴加生物素标记羊抗小鼠抗体15μL，37℃孵育30～45分钟，PBS洗3次。滴加SABC15μL，37℃孵育30～45分钟，PBS洗3次。滴加显色剂30～50μL，室温显色20～40分钟。可在显微镜下观察，待细胞膜上出现红色标记物时，用PBS淋洗。滴加细胞核复染液1滴，30秒后自来水淋洗。显微镜下观察结果。观察结果高倍镜下计数100～200个单个核细胞。计算阳性率。

阳性细胞：细胞表面呈红色。

①标准阳性：细胞表面呈红色，可见深蓝色细胞核；

②强阳性：细胞周缘及中央均呈红色，看不见细胞核；

③弱阳性：细胞表面呈淡红色，可见淡兰色细胞核；

④阴性细胞：细胞表面无着色反应，呈淡兰色。注意事项：为防止试剂受到污染，加样器吸头最好为一次性使用。分离单个核细胞中，将稀释血液加于分层液上时，务必要使之形成良好的界面，否则影响分离结果。孵育过程中，应将涂片置于湿盒中，操作中始终要注意保持涂片的湿润，以确保得到完美的实验结果。淋洗时不要直接对着细胞冲，避免细胞脱落。淋洗后，加试剂前须擦干细胞圈外水分，以免试剂流散。实验材料：实验动物：小鼠。细胞培养液。试管，滴管，离心机，培养皿，100目细胞筛等。选择小鼠，拉脱颈椎处死，用碘酒、酒精消毒皮毛。剪开皮肤，打开腹腔。找到红色的脾脏，用镊子分离后摘除。将脾脏放入盛有5-10ml培养液的平皿中轻轻漂洗，并细心剥除脾脏周围的结缔组织。将脾脏移入另一个盛有5-10ml培养液的平皿中，轻轻漂洗后置于100目细胞筛中，轻轻挤压使脾细胞通过筛孔进入培养液中，反复冲洗，以取得脾细胞悬液。1、分离小鼠脾细胞收集分离出的脾细胞，置于10ml离心管内加入培养液吹打，取10μl细胞，与10μl胎盘蓝染液混匀后染色并观察细胞活力，同时进行细胞计数。细胞活力观察（台盼蓝染色）：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，被染成淡蓝色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，可以鉴别死细胞与活细胞。细胞计数：采用细胞计数板。2、细胞活力观察及计数细胞计数：

步骤：①用乙醇清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干；②用微量移液器取少许细胞悬液（10μl），将细胞样本从室的一个口注入，液体在室中扩散，空气从另一个口排除；③观察计数板四角大方格中的细胞数，并计算细胞