常见微生物培养检测技术

常见微生物培养检测技术(一)培养基的种类和常用培养基培养基的概念：将细菌所需的各种营养物质按一定比例混合在一起,并调节到适宜的PH,这种人工配制的适合细菌生长繁殖的细菌营养物,称为培养基。培养基配制原则：培养基组分应适合细菌的营养特点营养营养协调理化条件适宜无菌1.培养基的种类按培养基的组成成分分类合成培养基、天然培养基按培养基的物理状态分类液体培养基、半固体培养基、固体培养基按培养基的功能分类基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基、厌氧培养基。(1)基础培养基含有培养一般细菌的最基本成分。又分为:液体培养基、固体培养基和半固体培养基三种。在液体(肉汤)培养基中,加入2%-3%琼脂即为固体培养基,加入0.2%-0.5%琼脂即为半固体培养基。(2)营养培养基于基础培养基中加入高营养物质如葡萄糖、血液、血清、腹水、生长因子等,以满足营养要求较高的细菌生长需要有的细菌还需加入特殊物质,如结核杆菌需加入鸡蛋清、马铃薯、甘油等才能良好生长(3)选择培养基利用细菌对某种物质敏感程度的不同,可在培养基中加入抑制某些细菌生长的药物,而选择性地让欲分离的细菌旺盛生长的培养基,如胆盐和蔷薇色酸可以选择性地抑制G+菌的生长,而不影响G－菌的生长。在培养基中加入二药后可选择性地分离出肠道杆菌。(4)鉴别培养基利用细菌分解底物及其代谢产物的不同,可在培养基中加入某种物质和指示剂,即制为鉴别培养基,以测定不同细菌的生化反应。紫黑色,具有金属光泽的菌落麦康凯平板：红色菌落(5)厌气培养基将培养基与空气及氧隔离,或降低培养基中的氧化还原电势,供厌氧菌生长。除去培养基中氧的方法：降低培养基中氧化还原电势：如肝汤或加入谷胱甘肽、硫基醋酸盐等。化合去氧法：如焦性没石子酸、好氧厌氧菌混合、种子发芽等。隔绝阻氧法：如液体石腊等。(二)细菌在培养基上的生长特征有关概念菌落:在固体培养基上,由单个细胞繁殖形成的肉眼可见的细菌集落,称为菌落。菌苔:在固体培养基上,大量菌落密集生长,融合成一片,称为菌苔。纯培养:挑取一个菌落到另一培养基桑培养,称为纯培养。不同的微生物种类,其菌落特征不同。同一种菌在不同培养条件下菌落特征也不尽相同,细菌的生长特征有助于细菌的鉴定。细菌分离培养形式及培养结果细菌细胞壁的主要成分是:肽聚糖(peptidoglycan),又称为粘肽(mucopeptide)或胞壁质(murein)。

丹麦病理学家革兰(HansChristianGram)为证实病组织切片中有细菌存在,在1884年介绍了脱色后再进行复染的鉴别染色法,后来被称为革兰染色法革兰阳性菌G＋(Grampositivebacteria)革兰阴性菌G－(Gramnegativebacteria)涂片结晶紫染色碘液媒染酒精脱色复红复染通过革兰氏染色法可将细菌分为G＋菌(蓝紫色)和G－菌(红色)两大类型。主要区别在于细胞壁结构不同。致病菌的检验程序标本直接涂片检查分离培养分子生物学技术(核酸杂交、PCR)生化试验血清学试验动物试验药敏试验其它(HPLC)细菌药敏试验结果同一细菌对不同抗生素的敏感性不同细菌对相同抗生素的敏感性病毒

病毒(Virus)：是形体微小、结构简单、仅含有一种核酸（DNA或RNA），能够通过细菌滤器,具有超级寄生性（严格的细胞内寄生），且必须在电子显微镜下才能观察到的一类非细胞形微生物。

1892年，伊万诺夫斯基和贝杰林克，烟草花叶病毒，开创了病毒学独立发展的历程。没有细胞结构可以透过细菌滤器只含一种核酸（DNA或RNA）严格细胞内寄生增殖方式为核酸复制对干扰素敏感，对抗生素不敏感病毒的基本特征（一）病毒的感染病毒与细胞相互作用称为病毒的感染。1.溶解性相互作用：病毒增殖,宿主细胞被破坏或溶解,也可不破坏细胞,形成稳定状态感染。2.转化性相互作用：病毒基因组与宿主细胞基因组整合,引起宿主细胞发生转化。有些非但抑制宿主细胞的生物合成,反而促进细胞分裂增生,导致肿瘤或细胞癌变。病毒的增殖（二）病毒的增殖病毒自身无完整的酶系统,不能进行独立的物质代谢,必须在活的宿主细胞内才能进行生活、复制和增殖由宿主细胞供应原料、能量和生物合成场所,在病毒核酸遗传密码的控制下,于宿主细胞内复制出病毒的核酸和合成病毒的蛋白质,进一步装配成大量的子代病毒,并将他们释放到细胞外,这种增殖方式称为复制病毒的复制周期（ReplicativeCircle）定义：自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒从感染细胞释放到细胞外的病毒复制过程称为病毒的复制周期。病毒的复制增殖过程,大致包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配和释放六个步骤。

ReplicationofvirulentphageLysogenicinfection1、吸附需要病毒表面特异性的吸附蛋白(VAP)与细胞表面受体(也称为病毒受体)相互作用,是决定感染成功与否的关键环节。细胞膜受体有脂蛋白受体和粘蛋白受体两种,除具有病毒吸附部位外,尚有促进病毒感染的作用。病毒的细胞受体具有种系和组织特异性,决定了病毒的宿主谱。2、穿入(侵入)病毒吸附于细胞膜后,细胞膜受体和邻近部位的膜发生折叠,将病毒吞陷,吞饮于泡内(牛痘病毒);或通过病毒与宿主细胞膜的融合进入细胞浆中(疱疹病毒);无包膜病毒则直接穿过细胞膜而入细胞(呼肠孤病毒);直接进入(裸露病毒)膜融合(包膜病毒)胞饮(包膜病毒)3、脱壳

感染性核酸从衣壳内释放出来的过程。有包膜病毒脱壳包括脱包膜和脱衣壳两步,无包膜病毒只需脱衣壳,方式随不同病毒而异。

病毒衣壳的脱落和核酸的逸出,主要在细胞浆(RNA病毒)或细胞核(DNA病毒)内完成。4、生物合成

病毒进入宿主细胞后生物合成阶段,胞浆中无病毒颗粒,称为隐蔽期(eclipse)。病毒的生物合成过程分早期和晚期两个阶段：1.早期:主要是由核酸(DNA或RNA)通过mRNA制造酶类蛋白质代谢工具和核酸基因组需要的核苷酸原料；2.晚期:主要是通过晚期mRNA合成病毒结构蛋白质。5、装配多数DNA病毒在细胞核内合成装配,RNA病毒在细胞浆内合成装配。6、释放有的病毒聚积在细胞空泡内后通过细胞通道向外溢出;有的依靠细胞膨胀破裂放出;有的则因细胞感染病毒后死亡裂解或自溶而释出。有囊膜的病毒多数借出芽而穿出细胞游离。一、动物接种动物选择标准:对病毒的易感性高;动物健康,体重、年龄尽可能一致,最好使用相应的等级实验动物,并符合所要培养病毒的要求;尽量使用遗传特性相似,个体差异较小,生物学反应比较一致的动物;外购动物,接种前要经过健康观察,以免误用带有病原体动物。可根据病毒性质、材料性质和目的不同,采取皮下接种法、皮内接种、肌肉接种、静脉接种、腹腔接种法、脑内接种法。二、禽胚培养理想的禽胚为SPF鸡胚。常用非免疫鸡胚加以补充,这种蛋应无特定病原的母源抗体,否则会影响病毒在胚内增殖。此外,不同病原对禽胚的适应性也不同,如狂犬病和减蛋综合征病毒在鸭胚中比鸡胚中更易增殖,鸡传染性喉气管炎病毒只能在鸡和火鸡胚内增殖,实际应用时而加以严格选择。常用的接种途径有绒毛尿囊膜法、尿囊腔法、羊膜腔法和卵黄囊法四种,根据不同的病毒和不同的目的采用适宜的接种途径。绒毛尿囊膜接种(10-13日龄胚)尿囊腔接种(9-11日龄胚)羊膜腔接种(10-12日龄胚)卵黄囊接种(5-8日龄胚)禽胚接种术式鸡胚不同接种途径与收获比较接种途径日龄方法破壳部位接种量(ml)收获尿囊膜10-13开蛋窗及人工气室或钻孔绒毛尿囊膜发育中心及气室0.05-0.1扩大蛋窗、收集接种部绒毛尿囊膜尿囊腔9-11钻孔胚胎面与气室交界边缘上、下约1mm处0.1-0.2破气室,收集尿囊液(5-8ml)羊膜腔10-12开蛋窗气室端靠近胚胎侧0.1-0.2扩大蛋窗,收集尿囊液及羊水卵黄囊5-8钻孔气室中心0.2-0.5破气室,