SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳课件

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳主要内容实验目的

实验原理

实验材料和试剂

实验步骤

结果处理实验目的了解电泳实验原理掌握电泳实验操作规程用电泳方法测定蛋白分子量SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近1：20时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29配制，试验表明它能分离大小相差只有3%的蛋白质。凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD）

1512～431016～687.536～945.057～212双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为1：29。实验材料和试剂试剂丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺十二烷基硫酸钠（SDS）用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)过硫酸铵Tris-甘氨酸电泳缓冲液样品处理液（50mMTris-HCl(pH6.8)，100mMDTT(or5%巯基乙醇)，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油）染色液（0.1%考马斯亮蓝R250，40%甲醇10%冰醋酸）脱色液（10%甲醇，10%冰醋酸）聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入样品处理液，在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。按予定顺序加样，加样量通常为10～25μl（1.5mm厚的胶）。将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。3.用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。染色1～2小时或过夜。4.换脱色液脱色，需3～10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。此方法检测灵敏度为0.2～1.0mg。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。