高效液相色谱法2课件

1仪器分析第18章 高效液相色谱法Highperformanceliquidchromatography;HPLC(2)2高效液相色谱法的主要类型和原理高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择高效液相色谱仪高效液相色谱分析方法Introduction3

对流动相的要求：不与固定相发生化学反应。对样品有适宜的溶解度。必须与检测器相适宜。粘度小2.化学键合相色谱法的流动相5(2)溶剂的强度和选择性a.溶剂的极性和强度正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离。反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离。6正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：A>B>C正、反相色谱中极性和保留时间的关系7b.选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。8

GC：填充柱：

H=A+B/u+Cu

毛细管柱：H=B/u+Cu

HPLC：

H=A+Cu3.分离条件的选择(1)HPLC中的速率理论10

B=2Dm

DmT/

液气

THPLC为室温<TGC

Dm<<Dg

u>u最佳

(3~5倍）

B/u

可忽略不计b.纵向扩散(longitudinaldiffusion)11 C=Cm+Csm+Cs

Cs：化学键合相，单分子层。

C=Cm+Csm

HPLC：H=A+Cmu+Csmu

c.传质阻抗(masstransferresistance)13

Cm

dp2/Dm

Csm

dp2/DmC减小的措施：降低dp

增大Dm：低粘度流动相

增加柱温14流动相流速提高，色谱柱柱效降低（变化不如在GC中快）一般流量为1ml/min15HPLC的适宜条件：固定相与装柱：小粒度、均匀的球形键合相；匀浆法装柱。流动相：低粘度、低流量。（甲醇,1ml/min)

柱温：25C17b.反相键合相色谱法的分离条件一般以非极性键合相和固定相最常用ODS（C18），短链烷基键合相用于极性化合物的分离，苯基键合相适用于分离芳香化合物以及多羟基化合物（如黄酮苷类）流动相一般以极性最强的水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂可选择弱酸（醋酸）、弱碱（氨水）或缓冲盐（磷酸盐、醋酸盐）调节pH，抑制组分理解，增强保留调节流动相的离子强度也可改善分离效果18c.反相离子对色谱法的分离条件C8或C18键合相为固定相离子对试剂的选择酸类或带负电荷的物质，常用季铵盐分析碱类或带正电荷的物质，常用烷基磺酸盐离子对试剂浓度一般在3-10mmol/L流动相pH的选择调节pH使试样组分与离子对试剂全部离子化194.分离类型选择21流程动画221.输液系统(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性23

洗脱方式：等强度洗脱：isocraticelution

在一个分析周期内流动相组成保持恒定。梯度洗脱：gradientelution

在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH等。(2)梯度淋洗装置25(1)进样器：六通进样阀

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：2.分离和进样系统26(2)高效分离柱

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。29

应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：

灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。紫外检测器ultravioletdetector;UVD30a.可变波长检测器31b.光电二极管阵列检测器photodiodearraydetector;PDAD

紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。32光电二极管阵列检测器33工作原理化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的荧光；荧光强度（F）与激发光强度（I0）及荧光物质浓度（c）之间的关系为Q：量子产率 K：荧光收集效率 ε:摩尔吸光系数l：光径长度 (2)荧光检测器fluorophotometricdetector；FD34

特点：灵敏度高（高于紫外检测器）只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。是体内药物分析常用的检测器之一35(3)安培检测器amperometricdetector工作原理在电极间施加一恒定电位，当电活性组分经过电极表面时，发生氧化还原反应，产生电量（Q）的大小符合法拉第定律：Q=nFN。因此反应的电流（I）为n：每摩尔物质在氧化还原过程中转移的电子数F：法拉第常数 N：物质的摩尔数 t：时间36(4)蒸发光散色检测器

evaporativelightscatteringdetector;ELSD

流动相（样品）加热流动相蒸发除去组分形成气溶胶强光测定散射光强

I=k

mb37

特点：通用型：如糖类、氨基酸等分析适用于挥发性低于流动相的组分灵敏度低流动相必须是挥发的，不能含有缓冲盐38

组分+发光试剂激发态产物光辐射基态特点：灵敏度高选择性高不需光源(5)化学发光检测器39四、高效液相色谱分析方法40

色谱鉴定法化学鉴定法两谱联用鉴定法(1)定性方法色谱系统适用性内容：塔板数、分离度、拖尾因子和重复性41

外标法内标法(2)定量方法42例1.

用