受体研究技术课件

受体研究技术Techniquesinreceptorresearch

本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!相关帮助需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网biomean进行咨询，期待您的加入本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!第八章组织化学技术在受体定位中的应用第一节在受体定位中免疫组化的原理和方法免疫组化的原理免疫组织化学(Immunohistochemistry)又称免疫细胞化学(Immunocytochemistry)﹐其主要原理是用标记的抗体对细胞或组织内的相应抗原(受体)进行免疫化学反应,经过组织化学呈色后用显微镜观察受体在组织细胞中的分布和定位。膜受体或核受体Ag制备相应的特异性抗体标记抗体免疫组织化学测定本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!包括﹕1.抗原(受体)提取和纯化抗原可为完整蛋白或一段特异性片段。2.免疫动物或细胞融合(单克隆抗体)。3.抗体效价检测和提取。4.抗体标记。5.细胞和组织标本的制备。6.免疫组织化学反应和显色。7.观察和记录结果。免疫组织化学的全部过程本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!免疫组织化学标本的制备抗原(受体)的准确显示和定位与制备的组织和细胞标本质量密切相关细胞和组织标本的取材细胞和组织的固定组织切片*细胞和组织标本的取材细胞标本:细胞涂片组织标本:取新鲜组织,速冻或立即用固定剂固定.本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!保持细胞和组织的原有结构,防止组织自溶.不仅使细胞和组织内蛋白质凝固，终止和抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度地保存细胞和组织的抗原性及防止抗原的扩散。*细胞和组织的固定

1固定剂一般为醛类固定剂和醇类固定剂醛类固定剂醛类为交联剂，其作用是交联组织中的氨基，保存抗原于原位。其特点是组织穿透力强，收缩小。常见有:福尔马林,多聚甲醛等丙酮及醇类固定剂该类固定剂为沉淀剂,其作用是沉淀蛋白质和糖,组织穿透性很强,保存抗原的免疫活性较好.如乙醇,氯仿,冰醋酸等本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!固定组织时应注意:

*力求保持组织新鲜,勿使其干燥,尽快固定处理.

*组织块不易过大过厚,必须小于2cmx1.5cmx0.3cm,尤其是组织块厚度须保持在0.3cm以内.*固定剂必须有足够的量,在体积上一般大于组织20倍。*组织固定后,应充分水洗,去除固定剂,以减少固定剂造成的人为假像.本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!免疫组织化学方法免疫荧光组织化学免疫酶组织化学

免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体作为探针检测细胞内相应的抗原。(一)免疫荧光组织化学由于免疫组织化学的特异性、快速性和在细胞水平定位的敏感性与准确性，免疫荧光组织化学是免疫组织化学中广泛应用于受体定位的技术之一本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!免疫荧光组织化学分直接法,夹心发,间接法和补体法.其中直接法和间接法最为常用。直接法用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞中的抗原相结合，在荧光显微镜下可见抗原存在部位呈现特异性荧光.间接法先用Ab1与组织Ag结合,再用标记荧光的Ab2与Ab1结合形成抗原--抗体--荧光抗体复合物染色方法:BSA封闭---PBS冲洗---一抗---PBS冲洗---二抗---PBS冲洗---(防荧光淬灭封固剂或90%甘油PBS)封片本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!双重免疫荧光染色双重免疫荧光染色可在同一组织细胞标本上同时显示两种受体直接法A抗体用异硫氢酸荧光素(FITC)标记B抗体用得克萨斯红(TR)或四乙基罗丹名(TRITC)标记按适当比例混合一抗标记组织抗原是目前最广泛应用的双重免疫荧光组织化学技术。所用的一抗必需是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如：A抗体为多克隆抗体，来自家兔。B抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。二抗为两种不同荧光素标记(如FITC和TR)抗产生一抗的不同种属动物的IgG(例如：FITC标记的羊抗兔IgG，TR标记的羊抗小鼠IgG)。间接法本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!(二)免疫酶组织化学它是在抗原抗体特异反应存在的前提下，借助酶组织化学的手段，检测某种物质在组织细胞中的定位：即先将抗体与酶连接，抗体与组织内特异抗原反应，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物或具一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成份的定位.本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!①酶催化的底物必须是特异的且易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察；②所形成的终产物沉淀必须稳定,即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位。③酶标记过程中，酶与抗体连接不影响二者的活性。④被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物用于标记的酶应具备以下特点本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!该方法的基本原理为PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体来自相同种属的动物，特异性一抗与组织细胞中抗原结合，二抗作为桥抗体将过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物(PAP)连接在与组织细胞内抗原结合的一抗上.

过氧化物酶抗过氧化物酶法(PAP法)ABC复合物是将HRP连接在生物素上,再将生物素--HRP与卵白素结合而成。ABC法的基本原理是特异性一抗与组织细胞中抗原结合，生物素标记的二抗再与一抗结合，ABC复合物中的卵白素分别连接生物素标记的二抗和生物素标记的HRP,最后进行显色定位。

卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法(AvidinBiotin-PeroxidaseComplexMethod,ABC法).本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!A.用免疫酶组织化学ABC法显示甲状腺激素受体β2在大鼠中缝核神经无细胞核中的定位。B.用免疫前血清代替抗甲状腺激素受体β2抗体，所染色结果为阴性。标尺：50um.(YUANETAL.brainResearch2000,868:22)免疫酶组织化学ABC法本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!第二节在受体定位中原位杂交组织化学的原理和方法原位杂交组织化学

(InSituhybridizationHistochemistry)

是应用带有标记物的已知碱基序列为探针(Probe)与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后用与标记物相应的检测系统，通过放射自显影或免疫组织化学方法在核酸原有的位点进行细胞内定位观察。原位杂交组织化学是研究受体的mRNA在特定细胞中表达和定位的有力工具。许多受体有不同的亚型，有些受体亚型在药理学上仅有非常细微的差别。由于不同的亚型由不同的基因编码，检测其相应的mRNA可对不同的受体亚型进行鉴别和定位。本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!标记探针*最常用的标记物为放射性同位素3H的分辨力高,能得到良好的细胞定位，但放射自显影时间长，一般需几周或更长.32P能量最大,放射自显影时间较短，仅需几天，但分辨力低.35S标记的探针做原位杂交，其分辨力不及3H，但明显优于32P，能得到良好的定位，放射自显影时间约10天，比32P长，但比3H短.35S为目前原位杂交放射性标记物中应用最为广泛的一种同位素*另一类常见的标记物为地高辛(Digoxingenin)地高辛分子可被特异性抗体检测,方法简便,无放射性污染问题,且分辨力比较高。不足之处在于其敏感性较放射自显影低，且定量较为困难.本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!二原位杂交组织化学反应1放射性标记RNA探针的原位杂交*杂交前处理:杂交前用一系列溶液预处理,目的是通过降低探针与组织切片的静电结合，以减低非特异性背景着色.*杂交反应:温度一般在37-420C左右;过夜杂交;RNA探针在加入到杂交液之前，必需加热至800C变性,反应10分钟后，速置于冰上.探针的浓度一般为0.5-5.0μg/ml.*杂交后处理:包括RNA酶消化及一系列不同浓度不同温度的盐溶液漂洗.

本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!2放射性标记寡核苷酸探针的原位杂交用寡核苷酸探针进行原位杂交，其严格度可高于RNA探针。原因是寡核苷酸探针较短及DNA：RNA杂交体的稳定性远低于RNA:RNA杂交体。通常杂交温度为370C，长于36个碱基的寡核苷酸探针杂交温度可提高到420C。杂交温度低，所需的杂交时间要长，通常需过夜。常用探针浓度为0.5μg/ml。原位杂交组织化学反应的检测方法放射自显影检测将杂交后的切片----浸入核乳胶----取出凉干----防入暗盒密封---于40C冰箱内曝光----曝光时间(32P约需4-7天，3H约需2-3月，35S约需2-4周)本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!3

地高辛标记的RNA探针的原位杂交用标准的免疫组织化学检测,连接碱性磷酸酶的抗地高辛抗体与杂交体中的地高辛结合，用硝基蓝四唑(NBT)作为组织化学的底物进行显色.4原位杂交组织化学与免疫组织化学双重染色法双重染色法是先后在同一张切片或相邻切片用原位杂交组织化学和免疫组织化学进行染色，在同一细胞同时显示编码某种受体的mRNA和相应的受体或与其共存的其它蛋白质和多肽。邻片法可使原位杂交和免疫组化染色都获得理想的结果，易成功，但易产生空间误差和样本误差。同一张切片上进行双重染色法可克服这些误差，但第一次染色总要不同程度地影响第二次染色。本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!