实验二细菌基因组DNA的提取课件

细菌基因组DNA的提取一、实验原理1、核酸的分类DNA

主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA

存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。分离纯化核酸总的原则：

①应保证核酸一级结构的完整性；

②排除其它分子的污染。核酸纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。2、核酸制备的一般原则核酸制备时应注意的事项:①尽量简化操作步骤，缩短提取时间。②减少化学因素对核酸的降解。③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温④防止核酸的生物降解。

核酸酶的抑制和抑制剂

降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。3、核酸制备的一般方法和原理DNase抑制

①加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。RNase抑制①操作要带手套。②所有器皿要严格消毒，③试剂处理④低温操作⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。

核酸制备中常用的去垢剂

核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；

2．溶解核小体上的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；

3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠核酸制备中常用的酶

DNase

RNase

蛋白酶K

溶菌酶

细胞破碎

抽提去蛋白质沉淀核酸核酸提取的一般过程核酸样品的保存温度：

4℃（5℃）最佳和最简单-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存-20℃保存保存介质：

TE缓冲溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0二、材料、设备及试剂

菌种：大肠杆菌设备：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，涡旋振荡器，水浴锅（37℃、60℃

）试剂：LB液体培养基、RNA酶A、无水乙醇无菌水（或TE）缓冲液、10%的SDS、20mg/ml的蛋白酶K，、5mol/LNaCl、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、异丙醇、75%乙醇、CTAB/NaCl溶液(CTAB:5gCTAB溶于100ml0.5molNaCl中，加热到65度溶解。）1、培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.2ml的培养物离心12000rpm,1min。2、沉淀物加入570ul的无菌水（或TE）缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入30ul10%的SDS和10ul20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h，（加入3ul的溶菌酶50mg/ml效果更好）。3、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀，于60℃温育10min。(上下颠倒混匀)，离心，12000rpm,5min。4、取上清，加入等体积（约800ul）的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，离心12000rpm,5min，将上清液转至新管中。（抽提两次）5、加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，静止10分钟，离心,12000rpm,10min。6、沉淀用1ml的75%乙醇中洗涤，离心5min，弃上清液，重悬于30ul的无菌水（或TE）缓冲液。三、操作步骤四、注意事项——细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡四、注意事项——核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法四、注意事项——核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70