生物素亲和素系统

生物素-亲和素系统亲和素链霉亲和素生物素生物素衍生物及配体连接生物素亲和素系统的应用链霉亲和素磁珠制备链霉亲和素包被板制备生物素连接抗原/抗体实验生物素—链霉亲和素系统在项目的试验

郑州安图生物2008年亲和素(Avidin)一、来源：亲和素主要存在于鸡蛋清中，可通过离子交换和分子筛方法提纯，从1L蛋清中可提取纯亲和素15-25mg。亲和素可以在PH5-7的高盐缓冲液中结晶出来，但没有报道在等电点附近的缓冲液中可以结晶析出。二、分子量：亲和素由四个相同的亚单位组成，每个亚单位的肽链中有128个氨基酸残基，其中每条肽链含4个甘露糖，3个氨基葡糖，含糖量达1O%。每个亚单位的分子量约为15600，整个亲和素分子的分子量66000-69000。三、亲和力：亲和素的每个亚单位可结合一个生物素分子，即一个AV可结合4个生物素分子，二者之间的亲和力极强，亲和素常数（Ka）为10^15Ｌ／mol，比抗原与抗体间的亲和力（Ka＝10^5～11L／mol）至少高1万倍，因此二者的结合特异性高和稳定性好。1mg纯的亲和素的活性约为13—15U。三、等电点：PH=10.5四、活性基团：亲和素对官能团的修饰不敏感，对其20%的羧基基团进行脂化和59%的氨基基团进行酰胺化都不会影响其与生物素的结合。但是当对色氨酸和赖氨酸残基进行修饰时会显著影响其与生物素的结合活性。即使用对色氨酸特异性的2-hydroxy-5-nitrophenylbromide试剂对亲和素每个亚基上的一个色氨酸氧化，亲和素就完全丧失了与生物素的结合能力。赖氨酸对亲和素与生物素的结合也起着重要作用，氨基特异性试剂2，4二硝基氟苯与游离亲和素的反应较结合生物素的亲和素反应速度快说明了这一点。当每个亲和素亚基上引入二硝基基团后，亲和素的活性就会消失，证明亲和素亚基上的3个赖氨酸残基可能在生物素的结合位点。但是像三硝基氟苯和丹磺酰氯由于不易接近生物素的结合位点附近的赖氨酸残基因此不会对亲和素的活性造成影响。五、稳定性：亲和素对6M尿素和3M盐酸胍有耐受性，当盐酸胍浓度至3.5M时其生物素结合能力下降，至6M时四聚体降解为单体，但是当盐酸胍浓度再降低至3M时其结合生物素的能力又能恢复。亲和素与生物素的结合能力很强，在8M盐酸胍PH1.5条件下，亲和素与生物素可以完全解离。六、亲和素-生物素复合物稳定性：生物素-亲和素是已知的蛋白和配体间非共价结合的最强作用力（Ka=10^15M-L)，生物素和亲和素间的结合很迅速，而且一旦结合，不易受PH，温度，有机溶剂及蛋白酶的影响。温度、盐的影响：游离亲和素在85℃就会失活，但是生物素-亲和素复合物可在短时间内耐受132℃的高温。生物素-亲和素复合物对热的耐受能力依赖于盐的存在，在没有盐存在时，100℃10分钟约有88%的生物素-亲和素复合物解离，但在有盐存在的条件下，需120℃15分钟复合物才能完全解离。PH、变性剂影响：生物素-亲和素复合物在PH2-13或8M盐酸胍（中性）条件下不会受到影响，并可以用硫酸锌沉淀，但是沉淀出的复合物用70%蚁酸处理1小时会使亲和素不可逆失活。表面活性剂影响：C14

标记的亲和素与固相生物素的结合不受1%SDS,Tween20,Tween40,TritonX-100和两性表面活性剂的影响。而生物素化蛋白与固相亲和素的结合会受这些表面活性剂的影响而减弱，易于解离。因此将生物素化蛋白从固相亲和素上解离使用SDS和高温（95.6）即可。暗示亲和素与生物素化分子的结合会受表面活性剂的影响而降低。七、亲和素与生物素结合的随机性：尽管亲和素与生物素结合时需要亲和素亚基间的相互作用，但是多种实验证据表明亲和素与生物素的结合是随机的，即当一个亚基结合生物素后不会对其他亚基与生物素的结合造成影响，而链霉亲和素与生物素的结合具有协同效应。链霉亲和素(Streptavidin)一、来源：链霉亲和素是Streptomyces

avidinii菌培养过程中的分泌产物，主要通过2一亚氨基生物素亲和层析法提纯，1L培养液中含蛋白10-60mg；目前也有基因重组技术表达的链霉亲和素。二、分子量：一条完整的SA肽链中有159个氨基酸残基，其中甘、丙氨基酸含量较大，且又不含任何糖基，分子量为16450。SA在培养过程中受蛋白酶的作用，肽链可从N端的lO～l2位和G末端19-21位处断裂，使每条肽链只含125-127个氨基酸残基，分子量降为13O96～13254，此即核心SA，核心SA的分子量约54KD。后者的每条肽链仍可结合一个生物素分子，即一个完整的核心SA仍可结合4个生物素分子。三、活性：SA和AV的活性都是结合生物素的量来表示，1mg蛋白结合生物素的微克数就是该蛋白的活性单位。从分子量计算，AV的最高活性是15u，完整SA是14u，核心SA的分子量较低，最高活性可达l8u，但由于1分子蛋白都结合4分子生物素，故它们的应用效果相同。AV的活性基团是肽链中的4个色氨酸残基，SA的活性基团也是肽链中的色氨酸残基，当用对色氨酸特异的Koshlands试剂处理后，SA就丧失了和生物素结合的能力。最近实验又显示，酪氨酸残基对蛋白的活性也有作用，AV的每条肽链中只有一个酪氨酸残基(Tyr)，硝基苯磺酰氟(Nbs-F)只要平均修饰它的0.5个Tyr，就可使其完全失去活性。SA的每条肽链中含6个Tyr残基，Nbs-F也修饰其中的一半即3个可便SA失去结合生物素活性。链霉亲和素（SA）结构图四：等电点：PH=6.0在ELISA中的应用：由于SA的等电点低，表面带的正电荷少，因此它和聚苯乙烯板载体的静电吸附力弱，SA的阴性对照显色明显比AV低，这样在ELIsA上应用SA可进一步提高方法的灵敏度。亲和素与链霉亲和素的比较相同点：1、生物素结合能力：AV:13-15U,SA:14-18U2、活性中心依赖于色氨酸-赖氨酸：亲和素在氨基酸序列的70-70和110-111两个位点含有色氨酸-赖氨酸，链霉亲和素在氨基酸序列的79-80和120-121两个位点含有色氨酸-赖氨酸，但是亲和素较链霉亲和素更易于被N-溴代琥珀酰亚胺氧化。不同点：1、分子量：AV=66KD-69KD，SA=54KD2、等电点：AV=10.5，SA=6.0，AV带正电较多，非特异性结合较强，可通过醋酸酐等修饰降低表面所带正电荷，增加亲和素稀释液的PH和离子强度降低非特异性结合。3、位阻效应：SA的生物素结合位点较AV深，位阻效应较强，长臂生物素更适合。4、生物素的结合：AV随机结合，SA协同结合。5、氨基酸序列：AV含二硫键和10%糖，SA含甘氨酸丙氨酸较多，无糖和二硫键。亲和素和链霉亲和素氨基酸序列对比生物素（Biotin）1、概念：生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。2、分子式：

C10H16O3N2S分子量：244.313、结构式：咪唑酮环结合亲和素，四氢噻吩环侧链末端羧基结合蛋白质5、溶解特性：难溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜（DMSO)6、等电点：

PH=3.57、其它特性：羧基需经活化修饰才能结合蛋白质（羧基活化的生物素，称为活化生物素，也叫生物素衍生物）生物素衍生物的种类及特性按照生物素衍生物所结合的官能团种类主要有以下几种：1、结合氨基的生物素衍生物2、结合羰基（羧基、醛基、酮基）的生物素衍生物3、结合巯基的生物素衍生物4、结合酪氨酸和组氨酸残基的生物素衍生物5、结合核酸的生物素衍生物结合氨基的生物素衍生物1、生物素Ｎ－羟基丁二酰亚胺酯（biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS）

不溶于水，一般以DMF或DMSO溶解，可渗透过细胞膜，用于细胞内部蛋白的标记。MolecularWeight:341.38SpacerArmLength:13.5Å2、Biotinamidohexanoyl-6-aminohexanoicacidN-hydroxysuccinimide

(B-LC-LC-NHS)MolecularWeight:567.70SpacerArmLength:30.5Å在B-NHS分子中增加了2分子6-氨基己糖，增加了生物素与被标记蛋白间的距离，降低位阻效应（stetichindrance)。MolecularWeight:443.43SpacerArm:13.5Å3、Biotin3-sulfo-N-hydroxysuccinimideestersodiumsalt

(B-Sulfo-NHS)可溶于水，不能透过细胞膜，可用于细胞表面蛋白的标记。4、succinimidyl-2-(biotinamido)ethyl-1,3-dithiopropionate

(B-SS-NHS)MolecularWeight:504.65SpacerArm:24.3Å分子中的二硫键可以用DTT断开，使生物素化的蛋白与生物素分开，适用于亲和层析。结合氨基的生物素衍生物特点：1、对水和湿度敏感，用前应充分平衡至室温，避免吸潮。2、易水解，水解后失去活性，水解速度随PH值的升高而加快。中性PH的半衰期为2-4小时，PH=9时半衰期只为几分钟，所以应在使用前配置，未用完的试剂丢弃。3、不能使用含有游离氨基的缓冲液，如tris或甘氨酸缓冲液，因为这些缓冲液的氨基会与被标记物竞争反应，一般使用PBS、CB、MES缓冲液。4、与氨基反应的最适PH为7-9。5、适合结合中性偏碱性的蛋白。B-NHS与抗体的偶联抗体分子上的氨基末端和赖氨酸上均含有游离的氨基，抗体的分子量较大，有丰富的氨基可供标记。下图显示抗体上可以被标记的位点：所需试剂：DMSO或DMFPBS或其他不含氨基缓冲液，PH7-8透析袋/透析液0.05mol/L,pH7.2的PBS操作程序：按照下面的操作方法，大概每分子蛋白上会连接3-5个生物素。对于抗体这样的大分子蛋白，一般每个抗体分子上会连接约8-12个生物素。B-NHS与蛋白的比例可以根据实验需要调整。A、计算B-NHS的使用量要根据被标记的蛋白的量和浓度计算。通过控制B-NHS和蛋白的量可以控制标记的程度。当标记较低浓度的蛋白的时候需要更多的B-NHS以达到相同的标记效果。一般为达到最好的标记效果，对于10mg/ml蛋白，B-NHS的使用量≥12mol倍，对于2mg/ml蛋白，B-NHS的使用量≥20mol倍，示例：1ml2mg/mlIgG(150000MW)溶液，需要约27ul10mMB-NHS。1mlIgG×××

＝0.000266mmol2mgIgG1mlIgG1mmolIgG150000mgIgG20mmolB-NHS1mmolIgGB-NHS与抗体的偶联方法：0.00026mmolB-NHS××=26.6ulB-NHS1000000ulLL10mmolB、连接反应1、若B-NHS冻存，试验前平衡至室温。2、将蛋白用PBS溶解至2mg/ml。注：如果蛋白已经用PH7.2-8不含氨基的缓冲液溶解，可直接使用或用PBS稀释至所需浓度。若蛋白稀释液中含氨基的缓冲液，则需用PH7.2-8PBS缓冲液透析。3、使用前，将B-NHS用DMSO或DMF溶解至10mM。对于B-NHS，2.0mg溶解于590ul溶剂中即可。4、按照蛋白的量，向蛋白溶液中加入计算好的10mMB-NHS。5、冰浴反应2小时或室温反应30分钟。注：只要蛋白不降解或长菌，可延长反应时间。6、透析去除未反应或水解的生物素。尽管B-NHS是最常用的生物素衍生物，因为多数蛋白都含有游离氨基，但是对于有些蛋白，游离氨基位于活性位点附近或参与活性位点，对其修饰就会造成蛋白失活。对于抗体的偶联，如果抗体的抗原结合位点附近富含赖氨酸，抗体的活性就会受到影响，这时应该考虑用其他生物素衍生物进行偶联。1、Biotinhydrazide（BHZ，生物素酰肼）

MolecularFormula：C10H18N4O2S

MolecularWeight：258.34

solubility

：DMSO≤20

mg/mL

结合羰基的生物素衍生物BHZ是水合肼(hydrazinehydrate)与生物素的合成物，因在生物素的羧基侧链上带有肼基，故能标记带醛基的蛋白质。

2、Biotinamidohexanoicacidhydrazide

（长臂生物素酰肼）

N-(+)-Biotinyl-6-aminohexanoichydrazide

MolecularFormula：C16H29N5O3S

MolecularWeight：371.50

Solubility：DMSO25

mg/mL

长臂生物素酰肼是在生物素和肼基中间增加了一个氨基己酸，增长了键长，可减少位阻效应。3、Biocytin

hydrazidehydrochloride（BCHZ，肼化生物胞素）

Nε-(+)-Biotinyl-L-lysinehydrazidehydrochloride

MolecularFormula：C16H30N6O3S·HCl

MolecularWeight：422.97生物胞素为ε生物素赖氨酸，是生物素通过C=O基与赖氨酸的ε-氨基连接生成的化合物。BCHZ可与蛋白质的醛基和氨基结合，

生物素酰肼特点：1、末端含有氨基，可以通过EDC在PH4.5-5的MES缓冲液中与羧基反应形成酰氨键。反应中避免使用含有氨基（Tris、Glycine）和羧基（acetate、citrate）的缓冲液。2、末端的肼基可在PH接近中性（6.5-7.5）的缓冲液中与羰基（醛基、酮基）反应形成腙。3、适合标记糖蛋白、偏酸性的蛋白、酶、DNA。4、在水中的溶解性较差，小于5mM，在DMSO中溶解度可达到50mM。EDC连接含氨基和羧基分子的反应示意图Biotinhydrazide与含羧基分子的偶联：所需试剂：生物素酰肼：50mM生物素酰肼（DMSO溶解）MES缓冲液：0.1MMES,PH4.7-5.5。EDC溶液：EDC溶解于MES缓冲液中，终浓度约0.5M。配后立即使用。透析袋：10KD操作步骤：1、将蛋白（或含羧基分子）溶解于MES缓冲液中，浓度为5-10mg/ml。2、向1ml蛋白溶液中加入25ul生物素酰肼，混匀。3、向1ml蛋白溶液中加入12.5ulEDC溶液，混匀。4、室温振荡反应2小时或过夜。5、离心去除反应中产生的沉淀，透析去除未反应物质。生物素酰肼与糖蛋白偶联方法：所需试剂：生物素酰肼：50mM生物素酰肼。氧化缓冲液：0.1M醋酸盐缓冲液，PH5.5过碘酸钠溶液：20mM过碘酸钠，用氧化缓冲液溶解。使用前配置，用棕色瓶，避光。连接反应缓冲液：0.1MPBS缓冲液，0.15MNaCl，PH7.2，或其他中性偏碱性不含氨基缓冲液。糖蛋白溶液：2mg/ml，糖蛋白溶解在氧化缓冲液中。透析袋：分子量10kD操作步骤：1、向1ml凉的糖蛋白溶液中加入1ml凉的过碘酸钠溶液，混匀后4度或冰上避光反应30分钟。注：如果仅氧化硅酸基团，加50ul过碘酸钠溶液即可（过碘酸钠终浓度为1mM，而非10mM)。2、用连接反应缓冲液透析以除去多余的过碘酸钠并更换样本缓冲液。3、将50mM（12.9mg/ml)生物素酰肼和活化并透析过的糖蛋白1：9混合室温反应2小时。(注：最适的生物素酰肼和糖蛋白浓度需要通过实验确定）4、通过透析去除未反应的物质。生物素化的样本可以和未生物素化的样本保存条件相同。长臂生物素酰肼与糖蛋白偶联反应示意图IgG抗体分子中含有糖基和羧基因此可以使用生物素酰肼进行偶联，由于糖基位于IgG分子的Fc片断，远离抗原结合位点，因此将抗体用过碘酸钠氧化后与生物素酰肼偶联不会影响与抗原的结合活性。此方法更适合于多克隆抗体，因为多抗的糖基化水平较单抗高。下图是多抗包被在肼基磁珠上的反应示意图：比较B-NHS和B-Hydrozide与抗体的偶联，前者相当于随机偶联，后者相当于定点偶联。下面的表是研究者用3种偶联方法将抗鼠抗体偶联在磁珠表面的偶联效率的比较：以上的结果表明：3种偶联方法将抗鼠多抗偶联在磁珠表面的效率差别并不明显，但是3种方法偶联的抗鼠抗体对鼠IgG抗体的结合效果不同，定点偶联是随机偶联效果的1.6-1.7倍。说明随即偶联的抗体影响了其与抗原的结合。结合巯基的生物素衍生物1、Biotin-maleimide

(生物素-马来酰亚胺）N-Biotinoyl-N′-(6-maleimidohexanoyl)hydrazide

MolecularFormula：C20H29N5O5S

MolecularWeight：451.54

solubility

：aceticacid:20

mg/mL

2、1-Biotinamido-4-[4´-(maleimidomethyl)cyclohexanecarboxamido]butane

Biotin-BMCCFormula:C26H39N5O5SMolecularWeight:533.68SpacerArmLength:32.6ÅSolubility:~4.5mg/ml(8.5mM)inDMSO(slightlylesssolubleinDMF)3、BiotinPolyethyleneoxideIodoacetamide

Formula:C18H31IN4O5SMolecularWeight:542.43SpacerArm:24.7ÅNetMassAddition:414.19Solubility:≥25mg/mlinwaterorbuffer结合巯基的生物素衍生物的特点1、Biotin-BMCC和IodoacetylBiotin对湿度敏感，在水相中易水解，使用前应充分恢复至室温。未使用完的试剂应丢弃，不可存放。2、马来酰亚胺基团在PH6.5-7.5的缓冲液中与游离巯基反应形成稳定的硫醚键，

PH＞7.5时与氨基的反应和水解反应增强。在PH=7.0时马来酰亚胺与巯基的反应是与氨基反应的1000倍。3、iodoacetyl基团在PH7.5-8.5缓冲液中与巯基反应形成稳定的硫醚键，此反应是巯基取代碘的亲和取代反应，iodoacetyl摩尔数应略高于巯基。在没有巯基存在PH6.9-7.0的条件下，也可以与组氨酸反应，但反应速度慢（一周）。Iodoacetyl基团也可以在PH＞10时与氨基反应。4、多数蛋白中都含有半胱氨酸，但巯基都以二硫键的形势存在，需要用还原剂还原后才能与结合巯基的生物素衍生物反应，常用的还原剂是TCEP和MEA。也可以通过试剂SATA引入巯基。由于蛋白中的巯基都是以二硫键的形式存在，所以在偶联前应先将二硫键还原为巯基。以IgG抗体为例，IgG抗体的Fc和Fab片断均含有二硫键，如果二硫键全部被还原抗体就会失活，所以需用对IgG抗体Fc片断特异的温和还原剂2-MEA还原。2-MEA还原抗体的程序如下：操作程序：1、秤量6mg2-MEA放入容器中，向其中加入1mlIgG。2、盖好，振荡溶解2-MEA，置37度温箱中反应90分钟。3、反应结束后冷却至室温，透析(透析液中含10mMEDTA）或过柱去除2-MEA。4、将活化过的IgG用PBS-EDTA稀释至所需浓度，立即使用。IodoacetylBiotin与抗体的偶连：操作程序：1、使用前配制4mMIodoacetylBiotin。

2mgIodoacetyl-LC-Biotin溶解于1mlDMF。

2.2mgIodoacetyl-PEO2-Biotin溶解于1ml反应缓冲液。2、每ml还原的抗体中加入50ulIodoacetylBiotin溶液。3、室温避光震荡反应90分钟。4、透析去除未反应的物质。IodoacetylBiotin与含巯基分子反应示意图上图显示了B-NHS、B-HZ、B-BMCC偶联抗体后与Streptavidin反应的模式，从图上可以看出，B-NHS与抗体属于随机偶联，可能影响抗体与抗原的结合，而B-HZ、B-BMCC与抗体属于定向偶联，抗原结合位点暴露充分。结合酪氨酸和组氨酸的生物素衍生物p-diabenzoyl

biocytin（DBB）MolecularWeight：539.05SpacerArmLength：27.9Åp-diabenzoyl

biocytin（DBB）由生物胞素苯甲酰胺通过盐酸和亚硝酸钠重氮化反应制得，可以与酪氨酸的酚羟基邻位、组氨酸的咪唑基和色氨酸的吲哚环反应。文献介绍可以用来标记T3。重氮法连接酪氨酸、组氨酸、色氨酸反应图文献中重氮法生物素化T3的制备所需试剂：1、对氨基苯乙胺（APEA)CAS:13472-00-92、NHS-LC-Biotin3、NaHCO34、无水乙醇5、HCL6、NaNO27、DMF8、尿素试剂准备：1、对氨基苯乙胺溶解在DMF中，浓度为1.0%。2、NHS-LC-Biotin溶解在DMF中，浓度为1.12%。3、4%NaNO2溶液。4、2MHCL。5、T3溶解在2MNaOH溶液中，浓度为1.3%。制备程序：1、1mlAPEA溶液逐滴加入2.2mlNHS-LC-Biotin溶液中，震荡反应1小时。2、用NaHCO3缓冲液调节PH值到8.5。3、用无水乙醇将反应产物沉淀出来。4、0.02mM生物素化的APEA用1ml2MHCL溶解，然后冰浴环境中逐滴加入5mlNaNO2溶液。5、过量的硝酸用20mg尿素去除。6、混合物在低温环境中震荡反应2小时，结束后用200mgNaHCO3中和至中性。7、重氮盐逐滴加入1mlT3溶液中，震荡反应3小时。结合核酸的生物素衍生物1、PhotoactivatableBiotin（光敏生物素）MolecularWeight：533.65SpacerArmLength：30ÅStorage：storeproductprotectedfromlightat-20°C光敏生物素特点：1、硝基苯叠氮基团是光敏生物素的活性基团，在350nm波长的可见光下可被激活，可以与蛋白、双链DNA或单链DNA、RNA偶联。2、偶联方法简单，只需将光敏生物素与被偶联物混合放置350nm波长的可见光下即可，而且在这种物理条件下不会对分子结构造成改变。3、样品放置在紫外光下几分钟会变热，所以应让反应在冰浴环境下进行。4、反应的样本中不能含有带巯基的还原剂（DTT、2-MEA），他们会将叠氮基还原为氨基，影响光敏活化。5、在光活化反应中不能使用带有氨基的缓冲液（Tris、Glycine），硝基苯叠氮基团与氨基的反应会成为主要反应，从而影响了与目的基团的反应。2、1-(4-azidosalicylamido)-6(biotinamido)-hexane

Biotin-LC-ASAMolecularWeight

：503.62SpacerArmLength：29.9ÅStorage：

Storeproductat4°C,protecte