卫生理化检验 第三章 样品预处理

第三章样品预处理第一节样品预处理的意义样品预处理(samplepretreatment)是通过溶解、分解、分离富集、浓缩纯化等手段，将样品转变成适于操作的状态。一、 卫生理化检验样品的特点在卫生理化检验中，样品来源广泛，有空气、土壤、水、生物材料等；样品状态多样化，包括气态、液态、固态、胶体等各种状态；组成复杂，有无机物、有机物、而且存在的方式和化学结构有所不同；被测成分含量低，一般在ppm、ppb级甚至更低；干扰因素多，基体效应复杂，因而会出现一般分析化学中尚未出现的问题。二、 样品预处理的目的样品预处理应达到以下目的：①浓缩被测组分，提高测定的精密度和准确度；②消除共存组分对测定的干扰；③通过生成衍生物等转化处理，提高被测组分的响应值；④样品更易保存和运输；⑤去处有害成分，保护仪器、延长其使用寿命。三、 样品预处理的地位1．需要时间长一般卫生理化检验分析过程中耗时，样品采集6.0%；样品处理61.0%；分析测试6.0%；数据处理与报告结果27.0%。用于样品处理的时间是分析测试的10倍以上。2．对检验结果的影响大样品处理对检验结果的影响比分析测试的影响大，许多情况下检验项目的精密度、准确度甚至检测限，由样品处理的方法和处理过程决定。四、 样品预处理的评价依据目前，样品预处理方法多达数十种，但没有一种适合所有的不同样品或不同被测组分。即使同一被测物，如果样品所处环境不同，也需采用不同的预处理方式。因此要根据实际情况，统筹兼顾，从众多的方法中选出切实可行的预处理方法。合理选择样品预处理的方法，一般按照以下原则评价：①有效去处干扰测定的组分；②被测组分的回收率高；③操作简便、省时；④避免使用贵重试剂和仪器、成本低。⑤避免对人体健康和生态环境产生影响。第二节经典预处理技术一、样品的消化技术消化(digestion)是指分解过程，在分析化学中一般指分解和氧化。消化产物是易于溶解的单质或氧化物，因此消化处理主要用于元素分析。经典的样品消化技术分为干灰化法(dryashing)和湿消化法(wetdigestion)两大类。(一)干灰化法干灰化法是常用的无机化处理方法，用于破坏食品、土壤、生物材料和水样中的有机物。特点是方法简便、加入试剂种类少、有利于降低空白值。1．高温分解法常压高温分解法：将经粉碎或匀浆的样品1〜10g置于铂、镍、银或瓷坩锅中，先在100〜150°C下干燥并炭化，再置于高温电炉中于450〜500°C灼烧至样品灰分呈白色或浅灰色，经溶解、定容供分析测定。样品的干灰化一般不需添加试剂。为了促进样品分解或抑制样品挥发损失，可在样品中加入助灰化剂。常用的助灰化剂有硝酸、硫酸、磷酸二氢钠、氧化镁、硝酸镁、氯化钠等。在常压干灰化过程中助灰化剂可发挥多种作用：①加速样品中有机物的氧化。硝酸、硝酸镁、硝酸铝、过氧化氢均有此作用；②与易挥发组分生成难挥发物质。例如，硝酸镁可与砷生成难挥发的焦砷酸镁（Mg2As2O7）；③氧化钙、氧化镁可使样品分散疏松、不易结块，并使待测金属与坩锅壁隔绝，减少吸留损失；④中和灰分中的碱性组分，减少吸留损失。使用时,一定要注意助灰化剂的纯度，避免将杂质引入样品中。（2）高压干灰化法：通常在氧弹中进行。氧弹结构如图3-1。外壳为不锈钢，能耐高压。对某些特殊组分（如氟）的测定，要求用铂衬里，以免腐蚀设备、沾染试样。氧弹高压干灰化操作：将固体样品研成粉末、压片，置于瓷、铂或石英试样环中，挂于弹盖下的挂钩。如样品氧化反应缓慢，可加入助燃剂（如硝酸铵）；如样品氧化反应剧烈，则加入石英粉等惰性稀释剂。加盖并旋上套环，充入氧气至所需压力（2500〜4OOOkPa,25.5〜40.8标准大气压），通电使铂丝点燃试样片，燃烧产物由事先装入氧弹中的吸收液吸收。（3）氧瓶燃烧法：对于含易于挥发组分如汞、硒、砷和氟、氯、溴、碘等非金属元素样品的处理氧瓶燃烧法可有效地消化样品并避免挥发损失，氧燃烧瓶的结构如图3-2。样品0.1〜0.5g用无灰滤纸包好，夹在氧瓶磨口塞的铂丝上，在氧瓶中充入氧气和吸收液，点燃滤纸，迅速塞紧瓶塞，让其燃烧灰化，振荡瓶子使燃烧产物溶解于吸收液中。2．低温灰化法如图3-3，低温灰化法是利用低温等离子发生装置，在较低温度下使样品氧化分解。在高频电场（约13MHz）振荡下，氧形成氧等离子体。氧等离子体具有极强的氧化能力，可使大部分生物样品、食物样品在较低温度（100°C）下迅速灰化。其优点是灰化温度低、有机物能快速分解，灰化趋于彻底，减少了待测组分的挥发和吸留损失。由于炭粒残存量少，可降低炭的吸附损失、提高回收率。该法无需外加试剂，空白值低，操作方便，节约时间，是较理想的样品灰化方法。

（二）湿消化法湿法消化利用适当的酸、碱与氧化剂、催化剂一起与样品煮沸，将其中的有机物分解为CO2和H2O（二）湿消化法湿法消化利用适当的酸、碱与氧化1．硝酸-硫酸消化法这种混合消化液可用于多种生物样品和混浊污水的处理，但不宜用于消化含有碱土金属的样品。常用硫酸、硝酸的比例为2：5。操作时，先将硝酸与样品混合，加热蒸发至较小体积，再补加硝酸、硫酸加热至白烟冒尽，继续消化直至溶液无色透明，冷却后用水稀释。若有残渣，应进行过滤或加热溶解。2．硝酸-高氯酸消化法这种混合酸适用于消化含有难于氧化有机物的样品，因高氯酸的沸点较高，两种氧化剂足以破坏所有难于氧化的有机物。必须注意高氯酸与羟基化合物可生成不稳定的高氯酸酯而产生爆炸。为避免危险，应先加入硝酸将羟基化合物氧化并冷却后，再加混合酸进行消化。3．硫酸-硝酸-高氯酸法除了含有挥发性元素以外的所有含金属毒物的生物样品均可用此法消化。用这种混合酸消化时，因硝酸沸点较低，样品中大量有机物先与硝酸反应。随着硝酸的挥发，样品中大部分有机物被除去，剩下难以氧化的有机物能被高氯酸破坏。由于硫酸沸点很高，可留在反应器瓶内不被蒸干而有效防止高氯酸的爆炸。此外还有钼酸纳-硫酸-高氯酸消化法、锇酸-硫酸-高氯酸消化法用于快速消化生物样品；碱作为消化试剂的氢氧化钠-半胱胺酸消化法快速消化毛发样品等。可根据不同的样品合消化目的来选择其他行之有效的消化方法。二、样品的分离与富集技术分离与富集在卫生理化检验中是十分重要的环节。分离是将样品中的待测组分与其它共存组分分开，富集则是用适当的方法使待测组分聚集、浓缩，提高其在分析样品中的相对含量。卫生理化检验涉及的环境样品、生物样品及食物样品等，基体复杂，共存干扰组分较多，在分析测定前一般都要进行分离和富集。（一）沉淀法和共沉淀法利用沉淀反应进行分离的方法称为沉淀分离法，例如测定水样中的SO42-时，在酸性溶液中加入BaC,溶液，使之生成BaSO4沉淀而与水中的可溶性杂质分离。将沉淀物过滤、洗涤、烘干、灼烧、恒重，可以算得SO42-的含量。利用共沉淀现象来分离和富集待测组分的方法为共沉淀分离法。例如测定水中的痕量Pb2+，不能用一般方法直接使Pb2+沉淀，同时也不能作浓缩处理，因为在浓缩的同时，共存干扰组分的浓度也在增大。此时加入Na2CO3便与水中大量的Ca2+生成CaCO3沉淀，由于共沉淀作用，使痕量Pb2+被全部沉淀，再用酸将所得的沉淀溶解，溶解液中的Pb2+浓度大大提高，可以用于分析测定。1．沉淀分离法（1）形成氢氧化物沉淀不同金属离子生成氢氧化物所需的pH值不同，因此用缓冲溶液控制反应介质的pH值，可使待测离子被沉淀分离。例如氨-氯化铵缓冲溶液的pH值为

8〜9,可将A13+、Fe3+等高价离子与大多数一、二价金属离子分离。（2） 形成硫化物沉淀大多数金属离子都可生成硫化物沉淀，但它们的溶解度相差悬殊，通过调节介质的pH值来控制S2-浓度，就可以使那些形成硫化物离子与其他离子分离。例如，硫代乙酰胺水解生成的H2S可与Sb3+、Cu2+、Cd2+等离子生成硫化物沉淀，进行均相沉淀分离。（3） 形成有机物沉淀某些特殊的有机物与金属离子生成沉淀物，而对待测组分进行分离、富集更为有效。例如，在硫酸（1：9）介质中，用铜铁试剂（N-亚硝基苯胲铵）可以定量沉淀Fe3+、Ti4+、V5+而与干扰严重的A13+、Cr3+、Co2+、Ni2+等共存组分分离。又如，铜试剂（二乙氨基二硫代甲酸钠）可与许多金属离子生成螯合物沉淀，控制反应条件能有效沉淀Cu2+或其它多种重金属离子，与AP+及碱土金属离子分离。2．共沉淀法无机共沉淀剂有Al（OH）3、Fe（OH）3、AgI等胶状体，它们有比表面积大、吸附能力强的特点，可使一些痕量的共存组分共沉淀而被分离和富集。还有混晶共沉淀体系如BaSO4-RaSO4、BaSO4-PbSO4、MgNH4PO4-MgNH4AsO4等，用来分离富集痕量铅和镭。其他应用实例见表3-1。表3-1无机共沉淀剂对痕量元素的共沉淀作用共沉淀剂沉淀剂共沉淀痕量元素待测样品Fe氨水Pb水、牛奶等Fe铜铁试剂Ti、V、Zr矿泉水Fe、Al8-羟基喹啉Co、Cu、Ca、Ni、Yi生物材料Th氨水Mo海水AlPO43-Cr、Fe、Mn、Ru、Zn天然水有机共沉淀剂能与待测组分形成离子缔合物和难溶螯合物而使痕量元素共沉淀。甲基紫、孔雀绿等有机化合物在酸性溶液中以代正电荷阳离子的形式存在，遇到以酸根阴离子或以配阴离子形式存在的金属离子时能生成难溶的离子缔合物。例如，在酸性溶液中Zn2+与过量的SCN-生成的Zn（SCN）42-遇甲基紫便生成难溶的离子缔合物并甲基紫阴离子和SCN-生成的离子缔合物沉淀而共沉淀。Hg2+、Bi3+、Sb3+、Ca2+等离子均可以用此方法被共沉淀。3.电解沉积（electrolyticdeposition）当基体组分为非电活性物质，而痕量被测组分能被电解沉积富集在电极上，随后加一反向电压使被测组分溶出或者直接进行仪器分析。待图3-4图3-4三电极电解富集装置示意图1.对电极；2.参比电极；3.工作电极；4.塑料湮；5.试液i6.搅样棒电解沉积通常用的是三电极装置（图3-4）。工作电极可以是悬汞滴、镀汞石墨棒、贵金属或石墨丝；参比电极多为饱和甘汞电极或氯化银电极。电解富集方法有控制电位沉积、恒电流沉积、外加恒电压沉积、内电解、置换沉淀等。电解沉积富集的金属可用两大类方法进行测定。一类方法测定单质形态，如X射线荧光光谱法、溶出伏安法和电位溶出法；另一类是测定原子化的形态，如原子吸收光谱法（AAS）、原子发射光谱法（AES）和原子荧光光谱法（AFS）。（二）溶剂萃取法利用物质在两种互不混溶的溶剂中的分配情况不同而进行分离的方法为溶剂萃取法（solventextraction），又称为液-液萃取法。一般情况下，两种溶剂为水和有机溶剂。溶剂萃取基本原理：1．直接萃取法这种萃取法应用最多。例如水中的碘可用CCl4于分液漏斗中振摇萃取；食品中的脂肪用乙醚或石油醚于索氏提取器进行萃取；食品中的农药用正己烷等有机溶剂进行萃取，共存的脂肪、色素与蜡质被一起萃取，再用乙腈或其它亲水性有机溶剂进行反萃取，农药进入乙腈而与其它组分分离。2．螯合物萃取法许多重金属离子与二硫腙形成螯合物后可被三氯甲烷、四氯化碳等有机溶剂萃取；Ni2+能在pH9的介质中与丁二肟生成螯合物，用三氯甲烷萃取，酸化后丁二肟镍又分解为Ni2+离子而进入水相；铜铁试剂、8-羟基喹啉等有机螯合剂可与金属离子生成疏水性螯合物，被有机溶剂提取。3•离子缔合物萃取法在水溶液中，一些含氧酸根如WO42-、V03-、ReO4-与碱性染料甲基紫阳离子生成疏水性的离子缔合物，可被苯或甲苯萃取。有机配体与金属离子形成配位阳离子，可与阴离子形成疏水性的离子缔合物而被分离。（三） 挥发法和蒸馏法挥发法和蒸馏法是将被分离组分转变成气体而与其它共存组分分离的一类方法，主要用于分离非金属、有机物和少数金属组分。挥发法在一定条件下待测组分生成挥发性组分，从试样中逸出而得到分离。所生成的挥发性组分被载气带出，也可以由适当的溶液吸收或直接加热蒸出。挥发法一般结合样品的分解进行。多数情况下是将有关组分转化成挥发性的氢化物、卤化物或螯合物。例如在强酸性介质中用锌或硼氢化钠作还原剂，可以使砷、锑、铋、锗、铅硒、碲、铟、铊等生成氢化物逸出。再如先将含Hg2+或有机汞的样品用硫酸-高锰酸钾进行冷消化，然后用酸性氯化亚锡将各种价态的汞还原为低沸点的元素汞，以空气或氮气将其吹出后进行冷原子吸收法或冷原子荧光法测定。顶空分析法（headspaceanalysis）本质上就是挥发分离分析。蒸馏法蒸馏法分离本质上与挥发法一样，有常压蒸馏、减压蒸馏和水蒸气蒸馏法。其优点是降低和避免沾污，水样处理中常应用，如测水中氨氮、氰化物、氟化物、挥发酚的分析中可有效与干扰成分分离。（四） 其他样品预处理方法其它常用样品预处理方法见表3-2。表3-2其它常用样品预处理方法方法原理适用范围离心分子量或密度不同不同相态或分子量相差较大的物质过滤颗粒或分子大小差别液-固分离透析渗透压不同分子与离子或渗透压不同的物质分步吸附吸附能力强弱气体、液体及可溶的物质冷冻干燥蒸气压不同在常压下易失去活性的各种物质索氏提取不同溶剂中溶解度差别从固体或粘稠态物质中提取目的物真空升华蒸气压不同从固体中分离挥发性物质超声振荡不同溶剂中溶解度差别从固体中分离可溶性物质衍生反应使被测成分改变性质而提高能与衍生化试剂起反应的物质灵敏度或选择性经典样品预处理方法的缺点：劳动强度大、处理周期长，样品易损失、重现性差（误差大），试剂消耗大、环境污染较大。第三节先进预处理技术一、微波溶样技术微波消化法（microwavedigestionmethod） 20世纪80年代后期开始应用并得到快速发展。其特点为：①快速，一般只要3〜4min可将样品彻底分解：②密闭，可避免损失和污染；③节能。（一） 微波溶样原理微波能穿透绝缘材料，但遇良导体则产生反射作用，介于上述二者之间的介电物质则吸收微波。微波能穿透聚四氟乙烯等容器直接作用于消化溶剂和样品。样品消化用微波炉频率均为2450MHS，高频电磁场一方面使水、酸、过氧化氢等溶剂以及样品中的极性分子快速转向和定向排列，产生剧烈的震动、摩擦和撞击作用，使试样与试剂的接触界面不断快速更新，加速了样品的分解；另一方面，样液中的各种离子在高频电磁场作用下产生快速变换方向的迁移运动，使离子与周围各种分子加剧碰撞而使体系升温，也有利于样品被撕裂、震碎和分解。这就是微波溶样高效快速的本质原因。（二） 微波溶样装置微波炉专用消化微波炉MDS-81D、MDS-2000（美国CEM公司），可程序控制（控制功率、时间等）；家用微波炉捎加改装便可使用，缺点是抗腐蚀性能较差，但价格便宜。消化容器消化容器的材料必须为微波能穿透的材料如玻璃、陶瓷、塑料等。以石英玻璃和聚四氟乙烯材质最好。敞开式容器的温度只能达到溶液的沸点，酸易腐蚀仪器设备，还可发生交叉污染、待测物的飞溅及挥发损失，因而逐渐被密闭容器所取代。用密闭容器消化样品，待测物和溶剂不易挥发损失，试剂用量少，空白值低，可显著降低检出限。在消化样品时能增压升温，并有自动卸压装置。防腐蚀安全装置有耐酸涂料内衬、泄压通气口、安全罩等。（三） 微波溶样技术的应用微波溶样技术对食品和生物样品的处理特别有效。用聚四氟乙烯杯分解牛肝、菠菜、西红柿、树叶、松针、牡蛎组织，可快速而有效地用ICP—AES测定其中的若干种元素；将微波加热与传统加热方法相结合，在聚四氟乙烯容器中先用hno3在电热板上预消化牡蛎、牛肝、稻米、小麦、人尿等试样，然后再加HNO3于每一份试样中，加盖密封，分两步用不同功率分解试样，均可取得良好的消化效果。小体积微波溶样技术也颇具特色。例如在石墨炉原子吸收光谱仪自动进样器的试样杯中用微波分解海虾，测定其中的Fe、Cu、Cd操作简便、快速，结果准确可靠。微波溶样技术虽大大提高了酸溶解试样的能力，但仍受到一些限制，如有些样品不得不用熔融法才能分解完全；有一些进入溶液的组分有时因生成沉淀而使测定结果偏低。此外，聚四氟乙烯材料在酸分解过程中经受高温高压，影响使用寿命。这些不足均有待改进。二、固相萃取法基本原理固相萃取法（solidphaseextraction,SPE）是基于液相色谱分离原理的一种快速有效的样品预处理技术。将样品溶液通过预先填充固定相填料的柱子，待测成分通过吸附、分配等形式被截留，然后用适当的溶剂洗脱，便达到分离、净化和富集的目的。根据分离机制不同，SPE可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、分子排阻色谱法及巯基棉分离法等。萃取装置和操作固相萃取装置的核心部分是C8、C18、腈基、氨基或其它特殊吸附填料，装上填料用以浓缩被测组分的萃取柱。柱材料聚丙烯塑料、玻璃或不锈钢，柱两端有多孔滤片，填料直径约40pm，总质量为0.1〜1g,这种短柱通常为一次性使用。为了加快样品流速，可将真空系统接在固相萃取装置上。固相萃取操作：先用适量溶剂将萃取柱中的固定相湿润，再加入一定体积的样品溶液使其完全通过固定相，溶液中被萃取组分保留在固定相中，然后加入适当的洗脱液从固定相中除去共存组分，最后用洗脱液将保留在固定相中的被测组分洗脱下来，收集分析。液相色谱所用的填料均可用于固相萃取，但固相萃取所需的填料颗粒粗一些（30〜60pm）,常用的填料有硅胶、硅镁吸附剂、氧化铝、硅藻土、聚酰胺、大孔树脂等。3．固相萃取法的应用固相萃取法用于水样的预处理效果最好。它可使处理1L水样的时间从数h缩短至10min,消耗有机溶剂从数百ml减少到几十ml。例如，水中痕量农药的分离富集用XAD-2、XAD-7聚苯乙烯树脂作吸附剂，取1〜100L水样通过树脂，其中农药被吸附，用25〜30ml极性溶剂洗脱。如果共存杂质较多，可再过弗罗里土柱，然后以适当的溶剂洗脱。通常先洗脱农药使脂肪、色素和蜡质等仍留在吸附柱上，从而使待测农药被分离与净化。又如玉米中的黄曲霉毒素可用Aflatest-10亲和柱分离富集。将样品提取液通过亲和柱，黄曲霉毒素被结合在装有抗体的亲和柱上，用水洗去杂质后，以甲醇定量溶出黄曲霉毒素，便可在荧光计上直接测定其含量，所得结果与荧光分光光度法测得的结果一致，但省时省力、操作简便。其它如尿中的汞、环境样品中的有机氯、有机磷、多氯联苯等污染物、可用固相萃取代替液-液萃取。三、超临界流体萃取超临界流体萃取（supercriticalfluidextraction,SFE）是近年来发展快、应用广的一种样品处理技术，在卫生理化检验领域是非常实用、有效的方法。1．基本原理超临界流体是介于气液之间的一类既非气态又非液态的物质，这种物态只能在温度和压力超过临界点时才能存在。同种物质的超临界物态和普通物态的物理性质差异较大，以CO2为例（表3-3）：表3-3不