限制性内切酶第二章

限制性内切酶第二章第1页，共90页，2023年，2月20日，星期三基因工程的基本流程第2页，共90页，2023年，2月20日，星期三TOOLSFORGENECLONINGSCISSORS:RESTRICTIONENZYMESGLUE:DNALIGASEVEHICLE:PLASMIDORVIRALVECTORS第3页，共90页，2023年，2月20日，星期三第二章

基因工程中常用的工具酶

第一节

限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第二节

DNA连接酶和DNA分子的体外连接第三节

其他工具酶第4页，共90页，2023年，2月20日，星期三一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第5页，共90页，2023年，2月20日，星期三一、限制性内切酶的发现和细菌的限制—修饰作用1、细菌的限制和修饰系统的发现1950年代初期，两组科学家几乎同时发现了限制修饰现象，当时称为宿主专一性:1952年，Luria,Humann等：T偶数噬菌体,

1953年，Bertani,Weigle等：λ和P2噬菌体。大量的研究结果证实λ噬菌体所表现的宿主限制和修饰现象更具普遍性和代表性。第6页，共90页，2023年，2月20日，星期三E.coli-λ噬菌体的限制修饰模式

噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。仍有少量λ(K)可在E.coliB中生存，是因E.coliB对λ(K)进行了修饰。第7页，共90页，2023年，2月20日，星期三1959年，瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论：

核酸内切酶降解细菌外源DNA,

修饰酶保护自身DNA2.细菌的限制—修饰理论的提出侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），能被限制性内切酶识别和降解，细菌通过这种方式进行自我保护。第8页，共90页，2023年，2月20日，星期三细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，①Dam甲基化酶--在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。②Dcm甲基化酶--在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入甲基。2.细菌的限制—修饰理论第9页，共90页，2023年，2月20日，星期三细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识别和水解。第10页，共90页，2023年，2月20日，星期三WernerArber于1962-1968年发现限制与修饰体系，1968年分离得到I型限制酶EcoB.1970年，H.Smith首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到II型限制酶HindⅡ.1971年，D.Nathans用HindII绘制了猿猴病毒SV40的限制酶谱。

Arber,Smith和Nathans获得了1978年Nobel生理学和医学奖。3.限制性核酸内切酶的发现第11页，共90页，2023年，2月20日，星期三到1986年下半年，发现615种限制酶和98种甲基化酶。到2006年2月，共发现4583种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3773种，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型限制酶各有68、3692、10种。3.限制性核酸内切酶的发现第12页，共90页，2023年，2月20日，星期三一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第13页，共90页，2023年，2月20日，星期三限制性内切酶系统中有两个部分组成：1.核酸酶2.甲基化酶•来源：细菌染色体、噬菌体/病毒•限制性内切酶不仅受病毒感染的影响，还可随DNA的连接、转导或转染而传给其他个体二、限制性核酸内切酶的定义•限制性内切酶是一组可以特异性地识别DNA上的某一特定序列，并将之水解的核酸酶。第14页，共90页，2023年，2月20日，星期三

限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。第15页，共90页，2023年，2月20日，星期三限制酶裂解DNA双链的磷酸二酯键酶切得到5`-P和3`-OH第16页，共90页，2023年，2月20日，星期三一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第17页，共90页，2023年，2月20日，星期三三、限制性核酸内切酶的命名①第1个字母大写，表示来源物种属名的第一个字母。②第2、3个字母小写，表示来源物种种名的前二个字母。③如果细菌有不同的血清型，则有第四个字母，小写，且与前3个字母紧紧排在一起。HindⅢ：Haemophilusinfluensaed④当控制宿主的限制、修饰系统的遗传因子位于病毒和质粒上时，需要在名称中标出遗传成分。EcoRI：EscherichiacoliR⑤若从一种细菌中分离出几种不同的酶，则根据发现顺序用罗马数字表示。Sac

I(II)：StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)第18页，共90页，2023年，2月20日，星期三一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第19页，共90页，2023年，2月20日，星期三性质酶Ⅰ酶Ⅱ酶Ⅲ结构与功能三亚基多功能酶单一功能的酶同型二聚体二亚基双功能的酶限制与修饰酶蛋白同时具有甲基化作用酶蛋白不具有甲基化作用酶蛋白同时具有甲基化作用限制作用的辅助因子ATP,Mg2+,SAM（S-腺苷甲硫氨酸）Mg2+ATP,Mg2+,SAM寄主特异性位点序列特异性,非对称序列特异性,旋转对称序列特异性,非对称序列切割位点在距寄主特异性位点至少1kb的地方位于寄主特异性位点或其附近在距寄主特异性位点3´端24~26bp处切割方式随机切割特异切割特异切割甲基化作用位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点在DNA克隆中的用途无十分有用有用四、限制性核酸内切酶的分类及主要特征第20页，共90页，2023年，2月20日，星期三一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第21页，共90页，2023年，2月20日，星期三五、II型限制性核酸内切酶的基本特性•是用途最广、最简单的一种限制性内切酶。•II型限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如PvuII(157个氨基酸)，也可以比1250个氨基酸的CjeI更大。在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。第22页，共90页，2023年，2月20日，星期三•根据酶的作用特点，II型限制性内切酶分为3类：A.最普遍的是HhaI、HindIII和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。有以下4种情况：

a)大部分这类酶都以同源二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；b)但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。c)一些酶识别连续的序列(如EcoRI识别GAATTC)d)而另一些识别不连续的序列(如BglI识别GCCNNNNNGGC)1、根据酶作用特点进行的分类五、II型限制性核酸内切酶的基本特性第23页，共90页，2023年，2月20日，星期三B.IIS型酶•另一种比较常见的酶是所谓的IIS型酶，比如FokI和AlwI，它们在识别位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右；它们识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。因此一些IIS型的酶在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可能更高。第24页，共90页，2023年，2月20日，星期三C.第三种II型限制性内切酶•第三种II型限制性内切酶(有时也被称为IV型限制性内切酶)是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同时具有限制和修饰酶活性。有些酶识别连续序列，并在识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别不连续的序列(如BcgI：CGANNNNNNTGC)，并在识别位点的两端切开DNA链，产生一小段含识别序列的片段。这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。他们在N端由一个负责切开DNA的功能域，这个域又与DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。第25页，共90页，2023年，2月20日，星期三识别位点与酶切位点高度一致，具有高度特异性极为稳定辅酶:Mg2+2、II型限制性内切酶的特点五、II型限制性核酸内切酶的基本特性第26页，共90页，2023年，2月20日，星期三（1）限制酶识别序列的长度限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列被称为识别序列。识别序列的长度一般为4～8个碱基，最常见的为6个碱基。切割频率理论上为1/4n（n为识别序列长度），实际上与序列有关。3、识别序列MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；

SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG

FokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外侧，产生５’-端突起五、II型限制性核酸内切酶的基本特性第27页，共90页，2023年，2月20日，星期三（3）限制酶识别序列的结构限制酶识别序列大多具有回文对称结构

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’有些限制酶的识别序列不对称AccBSⅠCCG↓CTCGGC↑GAG（2）富含GC第28页，共90页，2023年，2月20日，星期三Ⅱ型酶识别回文序列第29页，共90页，2023年，2月20日，星期三有些限制酶可识别多种序列

有些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。

AlwNⅠCAGNNNCTGGTCNNNGAC

AccⅠGTMKACCAKMTGM=A、CK=G、T第30页，共90页，2023年，2月20日，星期三（4）限制酶切割的位置限制酶对DNA的切割位置大多数在识别序列内部，但也有在外部的。（5）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ第31页，共90页，2023年，2月20日，星期三4．末端种类(切割方式)（1）5’-黏性末端和3’-黏性末端（cohesiveend）识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为黏性末端，这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。（2）平末端（Bluntend）在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生平末端。如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV（GAT↓ATC）五、II型限制性核酸内切酶的基本特性第32页，共90页，2023年，2月20日，星期三第33页，共90页，2023年，2月20日，星期三粘性末端的意义连接方便不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。第34页，共90页，2023年，2月20日，星期三第35页，共90页，2023年，2月20日，星期三第36页，共90页，2023年，2月20日，星期三第37页，共90页，2023年，2月20日，星期三第38页，共90页，2023年，2月20日，星期三5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。3’末端标记凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。粘性末端的意义第39页，共90页，2023年，2月20日，星期三部分常用的限制性内切酶第40页，共90页，2023年，2月20日，星期三（3）非互补黏性末端(不对称末端)当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的。

BbvCⅠ

CCTCAGCGGAGTCGCCTCAGCGGAGTCG第41页，共90页，2023年，2月20日，星期三能识别简并顺序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

第42页，共90页，2023年，2月20日，星期三第43页，共90页，2023年，2月20日，星期三(1).识别不同，切割不同

eg:BamHIEcoRI

-GGATCC- -AGATCT-

-CCTAGG--TCTAGA-

(2).识别不同，切割产生末端相同(同尾酶)

eg:BamHI Bg1Ⅱ

-AGATCT-GGATCC

-TCTAGA-CCTAGG5.识别位点与切割方式之间的关系五、II型限制性核酸内切酶的基本特性第44页，共90页，2023年，2月20日，星期三(3).识别相同，切割不同

eg:SmaI XmaI-CCCGGG- -CCCGG

-GGGCCC--GGGCCC-

(4)．识别相同，切割相同──同工酶同裂酶

eg:HpaⅡ MspⅠ

-CCGG- -C*CGG-

-GGCC- -GGCC-

第45页，共90页，2023年，2月20日，星期三同裂酶（isoschizomers）

概念用途

有一些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，所以可以用来研究DNA甲基化作用。KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

有一些来源不同的限制性酶识别的是相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。第46页，共90页，2023年，2月20日，星期三

用途

如：限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶，共同的靶序列是CCGG。当其靶序列中含有一个5-甲基胞嘧啶（CCGG，*号表示甲基化的碱基），HpaⅡ不能够切割它，而MspⅠ对于这个核苷酸的甲基化作用的反应则是中性的，它不管C残基甲基化与否都能够切割之。*

现已研究发现，许多动物DNA中90%以上的甲基，都是在序列CG处以5-甲基胞嘧啶的形式出现。所以，通过比较HpaⅡ和MspⅠ的DNA消化产物就可以检测出甲基化的存在。第47页，共90页，2023年，2月20日，星期三同尾酶（isocaudamer）

概念

常用的限制酶BamHⅠ、BacⅡ、BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切割DNA后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。

举例与同裂酶对应的一类限制性酶，它们虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。第48页，共90页，2023年，2月20日，星期三BamHI

5´...G^GATCC...3´3´...CCTAG^G...5´

BglII5´...A^GATCT...3´3´...TCTAG^A...5´Sau3A5´...^GATC...3´3´...CTAG^...5´

第49页，共90页，2023年，2月20日，星期三

用途由于同尾酶切割DNA后产生的是粘性末端，因此，可以通过粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来，这在基因克隆实验中是很有用处的。由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称为杂种位点（hybridsite）同尾酶的粘性末端互相结合后，形成的新位点，不能再被原来的酶所识别。第50页，共90页，2023年，2月20日，星期三5’-G

3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’

BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’

BamHIBglⅡSau3A同尾酶的粘性末端结合形成的新位点不能再被原来的酶识别BamHIGGATCCBglII

AGATCTMboI,Sau3AINGATCN第51页，共90页，2023年，2月20日，星期三6、酶切位点在DNA上出现的频率•II型限制性内切酶的酶切位点在DNA上出现的频率受DNA的长度、识别位点的长度以及GC含量的影响。•当GC：AT＝1：14bp的识别位点：1/44＝256bp如：HaeIIIGGCC6bp的识别位点：1/46＝4096bp•因此当一个酶的识别位点为6bp时，在DNA上每4000bp才会出现一次。五、II型限制性核酸内切酶的基本特性第52页，共90页，2023年，2月20日，星期三•

另外一些不常见的酶识别位点相对较长，在DNA链上出现频率也相对较低。①如FseIGGCCGGCC，出现频率为1/48。•实际上由于不同生物体的DNA碱基含量不同，酶的识别位点的分布和频率也不同。②大肠杆菌基因组中AT含量较丰富，所以富含AT的识别序列(如DraI：TTTAAA；PshBI：ATTATT；SspI：AATTAA)较为频繁的出现；③链霉菌基因组因GC含量高，相应的富含GC碱基对的识别序列(NaeI：GCCGGC；SmaI：CCCGGG-；SacII：CCGCGG)较常见。•真核生物中，DNA中的CG:GC=1:3，这也影响酶切位点的出现频率。第53页，共90页，2023年，2月20日，星期三7五、II型限制性核酸内切酶的基本特性第54页，共90页，2023年，2月20日，星期三第55页，共90页，2023年，2月20日，星期三8、对寡核苷酸的活性•尽管是双链、有识别位点，但因为太短，酶不能与DNA有效结合，所以不能切割。•当2个酶切位点距离非常近的时候，它们之间由于竞争结合位点，所以也会相互干扰。五、II型限制性核酸内切酶的基本特性第56页，共90页，2023年，2月20日，星期三9.其它特异性的内切酶及其用途1.λ末端酶（λterminase）：

5’-GGGCGGCGACCTN--3’N--5’，出现的频率约412

分子量为

117,000=1A（74,000）+2Nul（21,000）2.Omega核酸酶（I-SceI）：

由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418=6.9X1010bp，其识别顺序为

5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’

TATT

3.I-PpoI：来自于Physarumpolycephalum

识别序列：CTCTCTTAAGGTAGC

AATT4.用途:遗传标记，构建载体五、II型限制性核酸内切酶的基本特性第57页，共90页，2023年，2月20日，星期三一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响限制性内切酶活性的因素七、限制内切酶的用途第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第58页，共90页，2023年，2月20日，星期三Ⅱ型限制性内切酶的反应条件第59页，共90页，2023年，2月20日，星期三五、影响限制性内切酶活性的因素

酶的纯度

DNA样品的纯度

DNA的甲基化程度酶切反应的温度和时间

DNA分子的结构限制性内切核酸酶的反应缓冲液六、影响限制性内切酶活性的因素第60页，共90页，2023年，2月20日，星期三高质量的限制性核酸内切酶，要求:

不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染;

长时间酶解不出现识别顺序特异性的下降;

酶解的DNA片段连接后能重新被识别和切割等.

酶的纯度第61页，共90页，2023年，2月20日，星期三1.DNA制剂中可能抑制限制性核酸内切酶活性的物质:

蛋白质、酚、氯仿、酒精乙二胺四乙酸（EDTA）十二烷基硫酸钠（SDS）高浓度的盐离子等

DNA样品的纯度第62页，共90页，2023年，2月20日，星期三2.提高限制性内切核酸酶对低浓低纯度DNA制剂反应效率的方法①纯化DNA；②增加核酸内切酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些；③扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被响应地稀释；④延长酶催化反应的保温时间。第63页，共90页，2023年，2月20日，星期三

DNA的甲基化1.原核生物的限制-修饰系统的组成成分是：甲基化酶：对自身DNA起修饰作用，从而使限制性内切核酸酶不能识别，保护自身DNA免受降解。限制性内切核酸酶：破坏入侵的外源DNA，防御异源遗传信息进入体内。因此，甲基化作用直接影响限制性内切核酸酶的活性第64页，共90页，2023年，2月20日，星期三

•大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：①选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；

DNA的甲基化第65页，共90页，2023年，2月20日，星期三第66页，共90页，2023年，2月20日，星期三

•解除限制修饰作用的方法：②利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coliJM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。

DNA的甲基化第67页，共90页，2023年，2月20日，星期三

酶切反应的温度

DNA酶切反应的温度是影响限制性内切核酸酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切酶，具有不同的最适温度，而且彼此之间有很大的变动范围。但是大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度都是37℃。第68页，共90页，2023年，2月20日，星期三酶反应温度（℃）ApaⅠBanⅠBstEⅡMaeⅠMaeⅡMaeⅢSmaⅠTaqⅠ3050604550552565部分限制性内切核酸酶的最适反应温度第69页，共90页，2023年，2月20日，星期三

DNA分子结构DNA分子的不同的构型对限制性内切核酸酶的活性也有很大的影响。

某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA高出许多倍，最高的可达20倍。第70页，共90页，2023年，2月20日，星期三DNA末端长度对限制酶切割的影响:限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。

DNA分子结构第71页，共90页，2023年，2月20日，星期三近末端的切割：

eg:AccIGGTCGACC

切不动

CGGTCGACCG 切不动

CCGGTCGACCGG切不动

eg:EcoRIGGAATTCC CGGAATTCCG

2小时内90%完全酶切

eg:PmeIGTTTAAAC 20小时不能切

GGTTTAAACC20小时，25%切开

GGGTTTAAACCC20小时，50%切开

AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG20小时，90%切开第72页，共90页，2023年，2月20日，星期三位点偏爱（Sitepreference）某些限制酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。λ噬菌体DNA全长48,502bp，有5个EcoRⅠ酶切位点。切割时并非在5个位点随机进行，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍。

DNA分子结构一般来说，一种限制性内切核酸酶对其不同识别位点切割速率的差别最多不会超过10倍。第73页，共90页，2023年，2月20日，星期三造成位点偏爱现象的原因

限制酶在切割DNA之前需要同时与两个识别位点作用；限制酶对要求作用的DNA序列有两个明显不同的结合位点，其中一个是为DNA切割时激活另一个的变构位点。

DNA分子结构第74页，共90页，2023年，2月20日，星期三

限制性核酸内切酶的反应缓冲液1.缓冲液的主要成分Tris-Cl：使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围内。对绝大数限制酶来说，最佳pH=7.4。MgCl2：保证酶活性的正常发挥。NaCl或KCl：同上。35第75页，共90页，2023年，2月20日，星期三β-巯基乙醇：防止限制酶的氧化，保持酶的稳定性（但也可能有利于潜在污染杂质的稳定性）。牛血清白蛋白（BSA）：对某些限制酶是必需的，它是一种中性蛋白，可防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。

限制性核酸内切酶的反应缓冲液1.缓冲液的主要成分第76页，共90页，2023年，2月20日，星期三2.缓冲液的分类

不同酶对缓冲液的离子强度要求不同，据此缓冲液可分为如下三种：低盐缓冲液（L）：10mmol/LNaCl

中盐缓冲液（M）：50mmol/LNaCl

高盐缓冲液（H）：100mmol/LNaCl

限制性核酸内切酶的反应缓冲液第77页，共90页，2023年，2月20日，星期三

限制性核酸内切酶的反应缓冲液3.限制性内切核酸酶的多酶联合酶解对盐浓度要求相同的酶，原则上可同时酶切第78页，共90页，2023年，2月20日，星期三对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：①低盐酶先切，然后补加NaCl，再用高盐酶切②一种酶先切，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一种缓冲液中用另一种酶切。③使用适合所有限制酶的通用缓冲液，如KGB（谷氨酸钾缓冲液）

限制性核酸内切酶的反应缓冲液3.限制性内切核酸酶的多酶联合酶解第79页，共90页，2023年，2月20日，星期三

限制性核酸内切酶的反应缓冲液4.星号活性（staractvity）

限制性内切核酸酶的识别位点是在特定的消化条件下测定的，当条件改变时，有些酶的识别位点也随之改变，可能切割一些与特异识别序列相类似的序列，这种现象称为星号活性。①概念实际上星号活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。第80页，共90页，2023年，2月20日，星期三

限制性核酸内切酶的反应缓冲液4.星号活性（staractvity）①概念（以EcoRⅠ为例）

EcoRⅠ在正常条件下识别并切割GAATTC，但在甘油浓度超过5%（V/V）时，也可切割NAATTN（其中N=A、T、C、G），用EcoRⅠ*表示。第81页，共90页，2023年，2月20日，星期三

限制性核酸内切酶的反应缓冲液4.