生物化学DNA复制与修复

生物化学DNA复制与修复第1页/共56页2

在宿主细胞中一些RNA病毒能以自身的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以自身RNA为模板逆转录合成DNA。

遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂过程中，通过DNA的复制把亲代细胞的遗传信息传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA翻译转变成相应的蛋白质，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。第2页/共56页3遗传的中心法则

——总结了生物体内遗传信息的流动规律揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传和变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以此为基础发展起来的基因工程，给人类的生产和生活带来了巨大的影响。第3页/共56页41、半保留复制

DNA复制时，以亲代DNA的两条链分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，组成新的DNA分子。新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，而另一条链是新合成的，因此这种复制方式称为半保留复制(semi-conservativereplication)。二、DNA复制的特点第4页/共56页5DNA半保留复制的实验依据1958年Meselson&stahl，用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验证明了DNA是采取半保留的方式进行复制15N培养基14N培养基14N培养基第5页/共56页6ABC

1963年，Cairns用放射自显影的方法首次观察到完整的正在复制的大肠杆菌染色体DNA。

将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA近两代的时间，使3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA中。然后用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，再通过放射自显影，得到下图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（B）仅有一股链有标记，另外一股双链（A）的两股链都有标记，银粒子密度为前二者的两倍。复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims实验)CAB第6页/共56页72、有一定的复制起点基因组能独立进行复制的单位，称为复制子（replicon）。每个复制子都含有控制复制的起点（origin），可能还有复制终点（terminus）。DNA的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制开始，就延续到完成复制为止。原核生物中的复制起始点通常为一个，而真核生物中为多个。大肠杆菌的复制起点（oriC），由245bp构成，关键序列在于三个13bp的序列和四个9bp的序列。GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白结合位点四个9bp序列大肠杆菌DNA复制起点成串排列的重复序列第7页/共56页83、需要引物

DNA聚合酶必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物(primer)

，才能开始合成子代DNA链。

RNA引物的大小，在原核生物中通常为50~100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。第8页/共56页94、多为双向复制

双向复制：多数复制从起始点向2个方向进行复制，有2个复制叉。

单向复制：少数复制从起始点向1个方向进行复制，只有1个复制叉。DNA双向复制：在复制过程结束前加入3H，通过放射自显影观察标记（红色），判断复制是双向还是单向。第9页/共56页103H标记大肠杆菌DNA结果表明两条链是同时复制的（红色表示新合成的链），电镜下观察到的复制过程，正好与放射自显影上所显示的相符。DNA双向复制可视图二：第10页/共56页115、半不连续复制由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为3'→5'。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。(leadingstrand)(laggingstrand)第11页/共56页12

以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子链，在复制时连续合成，子链的聚合方向为5'→3'，这一条新合成的子链被称为前导链(leadingstrand)或领头链。以5'→3'方向的亲代DNA链为模板，合成子链的过程不连续，这条链被称为随从链(laggingstrand)或滞后链。第12页/共56页13

DNA双链在复制时逐步解开，因此随从链的合成是一段一段的。

DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段长度，在原核生物中约为1000~2000个核苷酸，而真核生物中约为100~200个核苷酸。

第13页/共56页141、半保留复制2、有一定的复制起点3、引物4、双向复制5、半不连续复制DNA复制的特点第14页/共56页15三、DNA复制的条件

1、底物以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotidetriphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。

(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi2、模板(template)DNA复制是模板依赖性的，必须以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。第15页/共56页16第16页/共56页173、拓扑异构酶

除连环数不同外其他性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体（topologicalisomers），引起拓扑异构反应的酶称为拓扑异构酶（topoisomerase）。拓扑异构酶Ⅰ：能使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。拓扑异构酶Ⅱ：能使DNA的两条链发生断裂和再连接，引入超螺旋时需要ATP供给能量。原核生物的拓扑异构酶Ⅱ引入负超螺旋，而拓扑异构酶Ⅰ可减少负超螺旋。真核生物略有不同，但均在协同作用下控制着DNA的拓扑结构。第17页/共56页184、解链酶和单链DNA结合蛋白2.单链DNA结合蛋白（single-strandbindingprotein,SSB）:

是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。作用：稳定单链DNA，阻止DNA复性，避免被核酸酶降解，便于复制子代DNA。1.解链酶（helicase，解螺旋酶）：断裂互补碱基间的氢键，使DNA双链分离形成“复制叉”。第18页/共56页195、引发体和RNA引物引发体（primosome）：由引发前体与引物酶（primase）组装而成（解螺旋酶、引物和引物酶）。引发前体：由若干蛋白因子聚合而成的复合体。在原核生物中，引发前体至少由六种蛋白因子构成。引物酶：是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物（primer），以提供自由的3'-OH，使子代DNA链能够开始聚合。第19页/共56页206、DNA聚合酶①

DNA聚合酶种类：原核生物中，DNA聚合酶至少有五种，分别命名为DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ、DNA聚合酶Ⅳ、DNA聚合酶Ⅴ。

真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶α、DNA聚合酶β、DNA聚合酶γ、DNA聚合酶δ、DNA聚合酶ε。第20页/共56页21DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ）：是由单一肽链组成的大分子蛋白质，可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为Klenowfragment，具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性。②

DNA聚合酶生理功能：原核生物第21页/共56页22DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ

）：多个亚基组成，其中α亚基具有5‘→3’

聚合酶活性，因而具有复制DNA的功能；而ε亚基具有3‘→5’外切酶的活性，因此它与DNA复制的校对功能有关。γ亚基为依赖DNA的ATP酶DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）：为多亚基酶，其聚合酶亚基有一条多肽链组成，酶活力比DNA聚合酶Ⅰ高。除5'→3'

聚合酶活性外，还具有3'→5'

外切酶活性，但无5'→3'

外切酶活性。DNA聚合酶Ⅱ不是复制酶，而是修复酶。第22页/共56页23DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ：

1999年才被发现，涉及DNA的错误倾向修复（errorpronerepair）。当DNA受到较严重损伤时，即可诱导产生这两种酶进行修复，但修复缺乏准确性，因而出现高突变率。高突变率虽然会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以生存。第23页/共56页24

真核生物

DNA聚合酶α（polα）：参与染色体DNA复制（延长随从链）

DNA聚合酶β（polβ）：在其他聚合酶无活性时才发挥作用

DNA聚合酶γ（polγ）：参与线粒体DNA复制

DNA聚合酶δ（polδ）：参与染色体DNA复制（延长前导链）

DNA聚合酶ε（polε）：与DNA损伤修复、校正和填补缺口有关第24页/共56页25

原核生物中三种DNA聚合酶的性质比较第25页/共56页26

真核生物中DNA聚合酶的性质比较第26页/共56页27③DNA复制的忠实性：

DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制109~1010个碱基才出现一个误差（体外的错配率1/104~105）。对有4.6106个碱基对的大肠杆菌染色体来说，这意味着每进行1000~10000次复制才出现一次错误。

保证复制忠实性的原因主要有以下三点:1．DNA聚合酶的高度专一性：严格遵循碱基配对原则（错配率为710-6）

2．DNA聚合酶的校对功能：错配碱基被DNA聚合酶的3'→5'外切酶活力切除

3.起始时以RNA作为引物第27页/共56页28为什么RNA作为引物，能够保证DNA聚合过程的高度精确？第28页/共56页29DNA聚合酶具有35外切酶功能，以校正复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这也决定了DNA复制不能从头开始合成。因此，先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再利用53外切酶的功能进行切除，确保复制的忠实性。第29页/共56页307、DNA连接酶

催化双链DNA切口处的5’-磷酸基和3’-羟基生成磷酸二酯键，使两段DNA连接起来。DNA连接酶（DNAligase）：第30页/共56页31作用顺序DNA复制酶系四、DNA复制的过程第31页/共56页32大肠杆菌的DNA复制复制的起始①DNA复制起始位点：大肠杆菌的复制起点由245bp构成，其中有3个13bp和4个9bp的关键序列GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaA蛋白（20-40）ATP结合位点DnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点起始阶段的结构模型DNADnaA识别起始序列，解开双链DnaB解开DNA双链DnaC帮助DnaB结合于起点处HU类组蛋白使DNA弯曲，刺激复制的引发SSB结合单链DNARNA聚合酶促进DnaA活性TopII消除解链过程产生的扭曲张力第32页/共56页33②

解旋解链，形成复制叉：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。第33页/共56页34③组装引发体：由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体（解螺旋酶、引物和引物酶）。④引发：在引物酶（RNA聚合酶）的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。第34页/共56页352.复制的延长

DNA聚合酶，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α（延长随从链）和δ（延长领头链）。

第35页/共56页36引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。第36页/共56页37oric复制叉2复制叉1终止复制叉2终止复制叉1复制叉1复制叉2完成复制DNA拓扑异构酶IV连锁染色体3.复制的终止

复制的最后两个复制叉在终止区域相遇，这个区域有20个碱基对序列组成，叫Ter序列(terminus)

。Ter序列的功能是结合一种叫Tus的蛋白质。而Ter-Tus复合体能抑制前进的复制叉，使复制停止。DNA拓扑异构酶IV使复制的DNA分开。

第37页/共56页38①去除引物，填补缺口：

原核生物，由DNA聚合酶Ⅰ来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而真核生物的RNA引物，由一种特殊的核酸酶来水解，冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。第38页/共56页39②连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。第39页/共56页404.真核生物端粒的形成：端粒（telomere）：指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。人端粒DNA由53方向的（TTAGGG）n反复串联组成，长约5~15kb，是非结构基因，不具编码蛋白质的功能。第40页/共56页41端粒酶（telomerase）：

端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它以自身RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。

线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶的催化下，进行延长反应。第41页/共56页42五、DNA的损伤与修复

1、DNA的损伤（突变）

DNA在复制过程和复制结束后都能引起DNA的损伤。自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂和重组等。原因：生物因素，物理因素，化学因素来源：细胞内部，细胞外部部位：DNA的碱基，糖，磷酸二酯键第42页/共56页43（一）引起突变的因素：1．自发因素：(1)自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。(2)自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶（CA），腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤（AI）。每日可达几十到几百个核苷酸残基。(3)复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。第43页/共56页442．物理因素：由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。第44页/共56页453．化学因素：(1)脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。(2)烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。(3)DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。(4)碱基类似物：如5-FU，5-BU等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。(5)断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。第45页/共56页46（二）DNA突变的类型：第46页/共56页47（三）DNA突变的效应：

1．同义突变：基因突变导致mRNA密码子第三位碱基的改变，但不引起密码子意义的改变，其翻译产物中的氨基酸残基顺序不变，但有时可引起翻译效率降低。

2．误义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。

3．无义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换而改变成终止密码子，引起多肽链合成的终止。

4．移码突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，引起突变点之后的氨基酸残基顺序全部发生改变。

第47页/共56页482、DNA损伤的修复

DNA损伤的修复：可分为直接修复和取代修复两大类。第48页/共56页49（一）直接修复：1．光复活（lightrepairing）：这是一种广泛存在的修复作用。光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。其修复过程：光复活酶（photo-lyase）识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物→在300~600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复→光复活酶从