基因表达的定量检测分析

基因表达的定量检测分析现在是1页\一共有40页\编辑于星期三基因表达的定量检测方法1.蛋白表达水平的检测：1）定量检测分析：westernblotting、ELISA、HPLC2）蛋白质功能分析：

蛋白质亚细胞定位分析：免疫荧光技术

蛋白相互作用研究：酵母双杂交、免疫共沉淀（IP）、

荧光共振能量转移（FRET）

酶活性检测：ELISA、HPLC2.mRNA表达水平检测：1）半定量RT-PCR2）Northernblot

3）实时荧光定量PCR（RealtimePCR）

现在是2页\一共有40页\编辑于星期三Northernblot杂交

是用来检测真核生物RNA的表达量和大小，以估计其丰度的实验方法，可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。其基本步骤包括：1.完整mRNA的分离2.根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离3.将RNA转移到固相支持物（尼龙膜）上，在转移的过程中，

要保持RNA在凝胶中的相对分布4.将RNA固定到支持物上（UV交联）5.固相RNA与探针分子（DNA或RNA）杂交6.除去非特异结合到固相支持物上的探针分子7.对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析现在是3页\一共有40页\编辑于星期三RealtimePCR现在是4页\一共有40页\编辑于星期三实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。现在是5页\一共有40页\编辑于星期三实时荧光定量PCR原理

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线或内参基因的关系对起始模板进行定量分析的方法。与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。现在是6页\一共有40页\编辑于星期三一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：

荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。现在是7页\一共有40页\编辑于星期三

在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。

而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。

只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和

CT值。

荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）现在是8页\一共有40页\编辑于星期三几个常用名词概念1.Ct值的定义

C代表Cycle，t代表threshold（阈值，临界值），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。现在是9页\一共有40页\编辑于星期三2.荧光域值（threshold）的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-153.Ct值与起始模板的关系

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。现在是10页\一共有40页\编辑于星期三前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的

最初阶段现在是11页\一共有40页\编辑于星期三绝对定量分析：

Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系现在是12页\一共有40页\编辑于星期三质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用现在是13页\一共有40页\编辑于星期三现在是14页\一共有40页\编辑于星期三相对定量分析必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。管家基因：维持细胞基本代谢活动所必须的基因，如GAPDH、Actin、HPRT等现在是15页\一共有40页\编辑于星期三现在是16页\一共有40页\编辑于星期三现在是17页\一共有40页\编辑于星期三现在是18页\一共有40页\编辑于星期三现在是19页\一共有40页\编辑于星期三现在是20页\一共有40页\编辑于星期三现在是21页\一共有40页\编辑于星期三现在是22页\一共有40页\编辑于星期三现在是23页\一共有40页\编辑于星期三现在是24页\一共有40页\编辑于星期三优点：价格便宜，使用方便，不用设计复杂的探针。缺点：无模板特异性，对引物特异性要求比较高，

不能进行多重定量分析现在是25页\一共有40页\编辑于星期三现在是26页\一共有40页\编辑于星期三现在是27页\一共有40页\编辑于星期三TaqmanProbeMolecularBeacon背景荧光更低现在是28页\一共有40页\编辑于星期三反应优化反应液组成、体积50ul绝对不必要20ul应用广，但成本高推荐10ul，但需要优化引物与引物、引物与探针浓度配比4×4组合，50nm,300nm,600nm,900nm探针50nm,100nm,250nm

现在是29页\一共有40页\编辑于星期三qPCR一般使用二步PCR扩增，在退火-延伸整合步骤结束时进行信号检测。当PCR反映效率低时可以使用三步PCR扩增。染料法可以在72℃延伸结束时检测。探针法只能在退火结束时检测。现在是30页\一共有40页\编辑于星期三现在是31页\一共有40页\编辑于星期三现在是32页\一共有40页\编辑于星期三现在是33页\一共有40页\编辑于星期三现