2015+SOGC技术更新：胚胎植入前基因诊断和筛查(No.323)

技术更新：胚胎植入前遗传诊断和筛选摘要：目的：更新和检查植入前遗传诊断（PGD）和植入前遗传筛查（PGS）的技术和适应症。选项：讨论关于植入前生殖技术的遗传和技术，特别是那些使用新的细胞遗传学技术和胚胎活检。结果：包括使用PGD和PGS后的生殖技术的临床结果。该更新没有详细讨论与辅助生殖技术相关的不良后果。证据：发现的文献通过搜索Cochrane图书馆和Medline在2014年4月使用适当的控制词汇（非整倍性，囊胚/生理学，遗传疾病，植入前诊断/方法，体外受精）和关键词（例如植入前遗传诊断，植入前遗传筛选，全面染色体筛选，aCGH，SNP微阵列，qPCR和胚胎选择）。结果仅限于系统评价，随机对照试验/对照临床试验和1990年至2014年4月发表的观察性研究。没有语言限制。经常更新发现，并将其更新至2015年1月。从检索文章的参考书目中确定了其他出版物。通过搜索卫生技术评估和卫生技术相关机构，临床实践指南收集，临床试验登记册，国家和国际医疗专业社会网站，确定了灰色（未发表）文献。价值观：本文件中的证据质量按照加拿大预防性保健工作组报告中的标准进行评级（表格1）。利益，危害和成本：本更新将向读者介绍新的植入前遗传概念，方向和技术，以及辅助生殖的主要危害和成本。关键词：植入前遗传诊断，植入前遗传筛选，全面染色体筛选，aCGH，SNP微阵列，qPCR，胚胎选择推荐：在进行植入前进行基因诊断之前，必须由经过认证的遗传咨询师提供遗传咨询，以确保患者充分了解生育缺陷患儿的风险，疾病对缺陷患儿的影响以及所有可用于植入前和产前诊断的检测方法的益处和限制。应该告知夫妻，如果可以通过在单个细胞或多个滋养外胚层细胞上进行的检测来鉴定异常，那么植入前遗传学诊断可以降低父母双亲生育携带遗传异常的儿童的风险。由于用于植入前遗传诊断的方法具有技术限制，包括可能导致假阳性，因此鼓励进行产前或产后检测以确认植入前遗传诊断的结果。与卵裂期活检相反，滋养外胚层活检暂无实验显示对胚胎发育产生影响。因此，尽可能地，选择滋养外胚层活检作为胚胎活检中的首选方法，应由经验丰富的人员执行。理想情况下，单基因遗传病的植入前遗传学诊断应用多重PCR，连同滋养外胚层活组织检查。推荐携带染色体易位的夫妇使用综合染色体筛选技术与胚胎植入前遗传诊断中的滋养外胚层活检，因为它与良好的临床结果相关。在进行胚胎植入前遗传筛选之前，必须由经过认证的遗传咨询师提供彻底的教育和咨询，以确保患者充分了解技术的局限性，错误的风险，以及是否需要进胚胎行植入前遗传筛查来改善体外受精的活产率。使用荧光原位杂交技术（FISH）在第3天胚胎活检中进行胚胎植入前遗传筛选与活产率降低有关，因此不应在体外受精中进行。使用综合染色体筛选技术对囊胚期活检进行胚胎植入前遗传筛选，可以提高植入率，并改善IVF周期中的胚胎选择，显示良好预后。前言鉴于新的细胞遗传学技术的出现，产前诊断的实践在过去十年中在产科和生殖科学领域取得了重大进展。虽然羊膜穿刺术和CVS已经成为传统产前检测的主要内容，但胚胎植入前遗传诊断的改进已经彻底改变了遗传诊断的世界，特别是在携带单基因疾病或染色体易位的患者中。胚胎植入前遗传检测是在植入和植入之前使用生殖技术进行胚胎的遗传分析。该技术在20世纪80年代后期首次开发，用PCR确定携带X连锁疾病患者的胚胎性别。这种做法允许仅选择植入未受影响的胚胎，从而避免常规产前检测后的选择性妊娠终止。在具有遗传疾病例如已知遗传突变（单基因疾病）的患者中，或者当亲本存在染色体异常时，使用分子生物学或细胞遗传学技术在植入之前对卵母细胞和胚胎进行遗传分析，作为胚胎植入前遗传诊断。虽然有争议，PGD也被用于性别选择，兼容HLA分型（为了救助先生患儿），并可以检测具有可变外显率（例如BRCA1,2状态）和晚期遗传的遗传性癌症疾病（例如亨廷顿舞蹈病）因此可能在某些临床和社会场合中发挥重要作用。胚胎植入前遗传检测的另一个应用在于不孕症的治疗中。实际上，现代人口统计学和延迟生育导致IVF作为受孕方法的使用增加。尽管取得了许多进展，但根据所使用的年龄组和方法，eSETIVF周期的活产率从27%到35%不等。胚胎状态（染色体完整），子宫内膜容受性和植入效率等因素被认为是这种低植入率的潜在病因。在接受IVF的妇女中观察到的妊娠率低的最可能原因是，在正常的胚胎显微镜形态中染色体异常（非整倍体）的发病率增加，特别是在那些高龄产妇和复发性妊娠失败中。因此，已经提出了植入整倍体胚胎作为增加植入和活产率并减少早期妊娠损失的方法。使用细胞遗传学技术进行非整倍体筛选的胚胎遗传检测的过程称为胚胎植入前遗传筛选。PGD和PGS均需要有IVF，ICSI可有可无，用于进行DNA取样的胚胎活检，遗传检测和选择的胚胎移植。可以从卵母细胞（极体）或从胚胎细胞中提取DNA，比如来自卵裂期胚胎的一个卵裂球或来自囊胚期胚胎的5至10个滋养外胚层细胞。然后使用分子生物学技术（PCR，PCR多重）或染色体易位和非整倍体，使用细胞遗传学技术如FISH或CCS（综合染色体筛查），检测单基因突变。后者是新出现的新的细胞遗传学技术，其中包括鉴定整个染色体组（24条染色体，22个常染色体+2个性染色体）°CCS可以通过微阵列技术（如aCGH和SNP）或通过qPCR实现。当细胞被检测时，胚胎保留在IVF培养基中。如果活检细胞或细胞显示不受PGD遗传疾病影响或在PGS中携带整倍体胚胎，则该特定胚胎被认为是植入到子宫中的适宜候选者。胚胎植入前遗传检测的主要局限性是其在实现植入和活产率方面的低效力。这可能可以通过IVF手术，胚胎活检技术，胚胎培养和遗传诊断中遇到的技术难题来解释。这种低怀孕率可以通过染色体异常胚胎（非整倍体）的植入进一步解释，尽管它已经被检测为没有所讨论的遗传病症，例如单基因突变或染色体易位。目前可以与24条染色体非整倍体筛选结合进行特异性基因突变的检测，这是增加PGD妊娠结局的理想方式。PGD和PGS的实践是复杂和侵入性的，它们可能与假阳性或假阴性结果相关。因此，必须采用多学科的方法，包括ART，遗传学，高危妊娠，伦理和心理学等专业人员的投入和协调。PGD目前用于减少遗传疾病向后代的传播，因此被提议用于单基因疾病（主导和隐性，常染色体或X连锁）和染色体结构异常携带者的诊断，包括但不限于平衡易位和罗氏易位，倒位，缺失和插入。PGS目前用于辅助生殖，通过植入整倍体胚胎来提高怀孕成功率，因此被提出用于孕妇年龄较大的妇女，伴有重复植入失败的夫妇，伴有重复不明原因流产的夫妇，以及伴有严重男性因素不育症的夫妇。细胞生物学技术的发展PGD的最早试验使用核型分析和PCR来对植入人类胚胎的性别以及孟德尔病进行PBs分析。到20世纪90年代中期，使用诸如FISH的细胞遗传学技术，允许对某些非整倍体和染色体易位进行移植前诊断，该技术对后面人类基因组的测序起到了极大的帮助。FISH技术后来显示出很大的技术局限性：只有一批染色体适合分析（最多12个探针）；解释通常很麻烦，因为杂交失败，信号重叠和分裂影响输出的准确性；更重要的是，许多研究显示该方法的临床结果没有差异。鉴于这些缺点，开发了其他新的细胞遗传学技术，例如aCGH，SNP微阵列和qPCR可以进行CCS（所有染色体筛查）。ArrayCGH主要的aCGH需要来自检测和对照样品的标记DNA；然后将标记的DNA与DNA微阵列杂交。通过扫描和成像阵列进行分析，然后测量相对于每个探针的两个杂交信号的强度。最后，一个计算机程序分析数据并生成一个情节。最初使用分裂中期细胞进行CGH的显微镜进行分析。为了准确和实际的原因，中期CGH很快被aCGH所取代。aCGH的评估是确定检测样本的DNA中是否存在任何定量偏差（额外的或缺失的DNA序列）。因此，它可以检测染色体拷贝数（例如三体或单体）和不平衡的染色体易位。平衡染色体重排如易位或反转（其中遗传物质仅重新排列，不丢失或获得）不能被CGH识别。SNPMicroarraySNP是在DNA特定位置或位点处存在两个或多个核苷酸列突变，这些突变其中可以存在于一个物种的不同染色体上。迄今为止，基因组已经验证了近4000万个SNP，主要在非编码区。大多数SNP阵列在所有染色体的长度上检测到66万到200万个SNP。对于分子细胞遗传学，分析杂合位点两个等位基因的强度比率允许高分辨率检测小区域中整个染色体的重复和缺失。在缺失的情况下，通过不存在杂合带来检测杂合性的丧失。SNP阵列还具有通过对父母进行基因分型来调查任何异常的父母来源的优点，允许检测单亲二体畸变等。因为基于SNP的方法提供额外的理论分辨率和原始信息信息，它们可能特别适合某些应用，例如单基因缺陷的PGD或易位染色体不平衡以及非整倍体综合检测。qPCR使用实时qPCR对24条染色体拷贝数进行分析的方法已被研究并被广泛验证。在该方法中，预扩增步骤，是在384孔的多孔板进行高阶多重PCR反应，以扩增每个染色体的每个臂上的至少两个序列。实时qPCR之后被用于快速定量每个产品，允许在基因组上进行比较。多重PCR是直接对样品进行的，以避免来自全基因组扩增的扩增偏差，并确保准确的拷贝数分析；因此仅适用于多细胞滋养外胚层样品。aCGH和SNP微阵列在检测前都需要WGA（单细胞扩增）。最近qPCR技术被应用在PGS中，并且在IVF中使用时已经显示出植入和活产率的改善。PGD和PGS中使用的不同细胞遗传学技术在表2中概述。胚胎生物学的阶段用于PGD或PGS目的的胚胎活检可以在IVF手术期间的不同胚胎发育阶段进行。该技术可以通过卵母细胞（一个或两个极体），卵裂期胚胎（一个卵裂球细胞）或囊胚期胚胎（5至10个滋养外胚层细胞）的活检来完成。极体活检这种活检技术通常在胚胎活检被认为是非法的国家（例如意大利，德国，奥地利）进行。PB（极体）切除需要通过创建透明带的开口进入卵母细胞周围的空间，这可以通过机械或激光解剖来完成。该过程可以通过在不同时间除去第一和第二PB,或理想地通过同时进行两次PB同时去除（ICSI后8至14小时）来完成。虽然PB分析为夫妻关于非整倍体起源的重要预后信息提供了重要的预测信息，但仍然有不断的讨论关于是否需要进行这种类型的活检。最近的研究表明，第一和第二PB都容易出现减数分裂的错误。不幸的是，这种技术在PGD期间使用时具有缺点，特别是其限于单独由母体DNA携带的遗传或染色体异常的诊断。在PGS中，由于与其成本效益（需要检测的卵母细胞数量很多）有关的问题，PB活检仍然是一个讨论的问题，PB活检方法无法检测出减数分裂后染色体异常的高发生率，鉴于减数分裂非整倍体的可能自我修正，PB活检的诊断准确性受到怀疑。卵裂期活检透明带的开放可以通过酸性酪氨酸溶液，机械解剖或通过激光切割来完成。卵裂期活检通常在体外发育的第3天通过提取一个卵裂球进行。之前文献显示提取两个卵裂球可能对胚胎发育有不利影响，因此应该避免。卵裂球活检的主要缺点是嵌合风险，这可能是胚胎植入前遗传技术遇到的假阳性或假阴性结果的原因。然而，这种技术与胚胎发育的第5天至第6天的新鲜胚胎移植相容，因为遗传结果通常在卵裂球活检后1至2天可用。囊胚期活检囊胚期活检技术包括在胚胎发育的第5天或第6天取5至10个滋养外胚层细胞。透明带的打开是通过机械或激光穿透在胚胎发育的第3天完成的。然后将这些胚胎放入用于囊胚期的扩展IVF培养物中，并通过提取疝内皮细胞进行囊胚活检。从100个或150个细胞的囊胚取5至10个滋养外胚层细胞对应于从6至8个细胞胚胎中取一个或两个卵裂球的比例较低的细胞损失比例（3.3%至10%），其中细胞含量将减少12.5%至33%。囊胚活检还提供比第3天活检更多的起始DNA模板，这将理论上导致PGD的敏感性和特异性改善，并且有较低的嵌合率。这种技术是合算的，因为很少的胚胎被检测，并且与过去十年的活产生活机会增加有关。然而，如果要进行冷冻胚胎移植，在PGD-PGS单位工作的胚胎学家应该经历胚胎培养和玻璃化。最近，与卵裂期活组织检查相比，滋养外胚层细胞活检已显示对胚泡生殖潜力没有影响，而卵裂期活检会降低39%。虽然每次移植的活产率可能会随着这种技术的进步而增加，但应注意的是，随着胚胎培养的延长，更多的患者将不能达到胚胎移条件；因此，应该仔细咨询夫妻关于这些技术限制和项目的更高成本。参见表3，以比较不同胚胎活组织检查的优点和缺点。单基因缺陷检测项目PGDPGD首先应用于基于PCR的X连锁病症的方法。这允许确定胚胎性别和未受影响的女性的移植。在这些早期PGD病例之后不久，开发了基于PCR的方案用于遗传性疾病，例如囊性纤维化和a-1-抗胰蛋白酶缺乏症。这些是基于包含致病突变及其检测的DNA片段的扩增。PCR策略变得更加复杂，使PGD可以被应用的疾病数量的增加和准确率的提高。目前通过PGD-PCR诊断的疾病数目约为200个，包括某些形式的遗传性癌症如视网膜母细胞瘤和乳腺癌易感基因（BRCA2）。PGD也被用于HLA分型等新应用。过去十年的ESHREPGD联盟数据分析表明，每个卵母细胞检索的临床妊娠率为22%，每个胚胎移植的临床妊娠率为29%。表4显示了根据ESHRE数据，2009年1月至12月期间进行PGD的不同单因素疾病样本。在这些报告中，提出了总共6160个周期的PGD或PGS，包括PGS-SS的IVF周期。其中，2580例（41.8%）用于PGD目的，其中针对单基因疾病（包括HLA分型）进行了1597次循环。进行PGS目的的另外3551（57.6%）周期，PGS-SS为29（0.5%）。虽然ESHRE数据仅代表全球进行的PGD病例的部分记录，但其表明PGD领域的总体趋势。PGD-PCR方案的开发在技术上是有挑战性的，因为DNA含量小（5至10pg/mL）。这需要大量的扩增循环，以使突变成为可视化的，这可能导致外来或亲代DNA具有高度的污染风险。围绕这个问题的一种解决方法是扩增额外的高变DNA片段以及用于诊断的等位基因。这种方法类似于DNA指纹图谱，并且能够通过识别来自非胚胎的等位基因来检测外源DNA来源的污染。来自同一亲本的两个等位基因的存在表明污染的DNA是亲本来源的，或者特异性胚胎是三体的，携带两个亲本染色体之一的拷贝。在这两种情况下，这种胚胎从移植中消除。此外，使用ICSI而不是IVF消除了精子或卵丘细胞污染的风险，并且常规用于所有PGD-PCR病例。剥离卵丘细胞的卵母细胞也是基于PCR的PGD的标准做法。所有基于单细胞的PCR检测常见的另一个问题是称为等位基因缺失的现象。ADO可以定义为单细胞中存在的亲本的一个等位基因的扩增失败。ADO的发病率有所不同，但在极端情况下已经影响了20%的扩增，并且在过去导致了一些误诊。位于同一染色体上并且靠近致病基因的一个或多个多态性标记的同时扩增可以确保基于PCR的PGD方法将不存在与ADO相关的错误。这种策略（多重PCR）通过评估突变本身或其遗传的多态性等位基因来有效地进行诊断，因为ADO在相同反应中极不可能影响两个扩增片段。通常，最可靠的PCR-PGD方案采用多重PCR。除扩增包含突变位点的DNA片段外，还扩增含有连锁多态性的多余片段以避免ADO引起的误诊，并扩增至少一个高度多态性的标记物，以检测可能的污染。另一种用于减少ADO的策略是囊胚期活检，用于单基因疾病的PGD的冷冻胚胎移植。更高的相关性参见表4关于单基因疾病中PGD的适应症的概述。染色体转录产物的PGD检测染色体易位的两种常见类型，罗氏易位和平衡易位，通常会有正常的表型。然而，他们仍然具有相关的生殖危险，如不孕症，自然流产以及精神发育迟缓或发育迟缓的婴儿的分娩。据报道，PGD后选择染色体正常和/或平衡胚胎的移植显着降低了怀孕和流产风险。几十年来，PGD是通过FISH或基于PCR的PGD方法进行的。与其中将胚胎细胞置于微量离心管中的PCR-PGD不同，用于染色体异常的PGD初始步骤涉及单细胞的扩增和固定及其随后的细胞遗传学分析。经典细胞遗传学技术（例如G带）不适用于单细胞水平，因为它们需要细胞分裂周期的中期阶段的染色体。然而，大多数胚胎卵裂球被发现处于间期。为了克服这个问题，PGD方案通常采用FISH的分子细胞遗传学方法。该技术涉及用不同颜色标记的染色体特异性DNA探针与扩散在显微镜载玻片上的细胞核或染色体杂交。无论是应用于中期还是间期细胞核，该方法都很快，表现相同。然而，FISH技术需要在每个IVF周期之前进行临床前验证，并且限于一定数量的染色体OFISH可能还有以下几个缺点，包括杂交失败，信号重叠和分裂，这可能会影响解释的准确性。基于PCR的流程可以在检测性能，自动化，周转时间，灵敏度和可靠性方面提供改进。这两种方法可能允许同时鉴定非整倍体，但仅限于有限数量的染色体，这可能导致非整倍体胚胎的植入孕妇体内，并且可能解释某些夫妇早期PGD的临床结果相对较低。FISH技术只能在单个细胞水平进行，因此与囊胚期活检中的PGD不相容。目前，世界各地对携带平衡易位或罗伯逊易位的夫妇使用aCGH和SNP微阵列进行滋养外胚层活检。他们不需要在每个IVF周期之前进行临床前验证，并允许同时筛选不平衡易位衍生物和所有24个染色体的非整倍体。Fiorentino等首先报到了在卵裂期胚胎阶段使用aCGH进行28个循环的PGD的染色体易位检测。大部分的胚胎（93%）被成功诊断出。适合移植的胚胎60%在开始循环中。实现了70%的怀孕率和64%的移植周期植入率。Colls等人最近通过用FISH-PGD重新分析所有诊断的胚胎，验证了aCGH的易位检测。我们最小的可检测片段，对于卵裂球为〜6Mbp，对于滋养外胚层为〜5Mbp。aCGH的错误率为1.9%。在926个FISH-PGD循环对易位检测的回顾性分析显示，所有易位片段均为＜6Mbp，因此可以通过CGH进行适当诊断。Treff等人报道了SNP阵列的PGD成功应用于区分来自易位载体的胚胎中的正常和平衡染色体。67%（12/18）在开始循环有合适的胚胎移植。每次移植的临床妊娠率为75%，获得了较高的45%的植入率。比较SNP-PGDC169对夫妇）和FISH-PGD（406对）的回顾性研究的最新结果显示，使用SNP阵列与造血干细胞活检和随后的冷冻胚胎移植联合的手术显着改善了易位携带者的持续怀孕率（69%与38%），并略有降低流产率。总体而言，从上述研究可以看出，用于染色体易位的aCGH和SNP微阵列理论上比FISH更好，因为它们允许同时筛选所有染色体中的易位和非整倍体。此外，它们与有利的临床结果相关，并且很快将成为携带染色体重排的夫妇的PGD检测标准。胚胎移植前遗传筛选最近已经使用这种技术通过筛选染色体非整倍体的胚胎来改善IVF周期的临床结果。胚胎移植中至少40%至60%的人类胚胎异常，而年龄在40岁以上的女性中，这一数字增加到80%。这些异常导致在IVF手术期间移植的胚胎中的植入率较低，从女性＜35岁的30%至40岁以上的6%。在最近的一项针对滋养外胚层活检的回顾中，非整倍体风险随女性年龄增长而升高。而年龄较小的女性患病率也略有上升，女性^23岁时非整倍体〉40%。染色体异常的胚胎移植的风险（非整倍体胚胎率）在26岁至37岁的女性中最低（2-6%），然后在42岁时升至33%，44岁时达到53%。IVF效率取决于两个因素：胚胎染色体状态和子宫内膜容受性。子宫内膜的接受能力可以通过减少卵巢刺激来改善，因此需要减少新鲜胚胎移植期间观察到的不利的高雌激素作用，或通过一段冷冻时间后移植胚胎。另一方面，胚胎的潜力主要取决于其染色体状态。理想情况下，通过将单个整倍体胚胎移植到子宫中，可以预期最高的植入率和潜力。已经开发了几种技术来通过全面的染色体筛选来评估胚胎染色体状态。由于大规模的随机试验和最近的荟萃分析显示，FISH为基础的PGS比没有PGS的结果更差，许多中心和建议阻止了NGS实践。迄今为止，在应用于良好预后的患者中，使用CCS（评估所有24条染色体）联合造血干细胞活检和随后的新鲜或冷冻胚胎移植都可以为PGS实践提供有利的临床结果。aCGH和SNP微阵列最近已被验证用于PGS并应用于活检卵裂球和滋养外胚层分析。Voullaire等人的早期报告和最近的一些数据显示，使用中期CGH的植入和妊娠率在PGS分析卵裂球中似乎比FISH有所改善。由Schoolcraft等人进行的临床应用这种新技术在胚胎期使用的研究已经产生了改善的临床结果，因为植入率胚胎移植周期（72.2%）比使用胚胎形态学标准单独用于胚胎选择（46.5%）更高。最近公布了正常对照患者的新的初始IVF结果数据单次胚胎移植后。清楚地显示，基于CCS（65.1%）的冷冻单囊胚移植组，基于形态的单独胚泡移植（52.6%）或第5天新鲜单胚移植（49.2%），组中植入率显着较高。经CCS接受单次囊胚移植的患者的IVF成功率的改善与母亲年龄无关。因此，染色体非整倍体筛查是实现日常eSET实践的全面目标的有希望的途径。当CCS与滋养外胚层活检相结合时，所有三种可用随机试验的植入率均高于传统的IVF护理。在CCS-PGS和对照组移植相同数量的胚胎的两项研究中，20周以上的持续怀孕率和分娩率均有所提高。在Forman等人的一项随机研究中，当移植单一的整倍体囊胚（按照CCS-PGS）时，观察到多胎妊娠率急剧下降，而妊娠率与使用2个未经检验的囊胚相当。此外，Dahdouh等人最近对随机对照试验进行了系统综述。表明，应用CCS与造血干细胞活检在PGS中的关系与IVF成功率的改善（超过20周的持续怀孕率增加）和胚胎选择增强有关。然而，这些结果来自具有良好卵巢储备的患者可用于活检的囊胚，因此使用该技术的PGS的成功率可能被高估，并且不能推广到其他患者群体。可应用于PGS/PGD的下一项技术是什么？已经开发了一种称为karyomapping的新型遗传学技术，为单基因疾病的PGD提供了有希望的工具，无需任何先前的患者或疾病特异性检测。该技术是基于父母单倍型之间映射交叉的全基因组遗传疾病分析的通用方法，包括同时检测单基因和染色体紊乱的综合方法。鉴于全基因组的测序技术已经开发，NGS现在正在PGS和PGD中应用于单基因突变和染色体易位检测。Treff等人使用靶向的NGS策略和多重PCR反应，其包括qPCR所需的突变位点和染色体特异性靶序列。该策略降低了准确测序突变位点所需的读取深