第四章反义核酸与核酶

第1页，共76页，2023年，2月20日，星期二反义药物第2页，共76页，2023年，2月20日，星期二主要内容一、反义核酸与反义技术反义核酸和反义技术概念反义核酸的基本原理反义核酸的种类反义核酸与反义技术的应用二、核酶技术及其应用核酶概述核酶与RNA修复核酶技术在临床上的应用核酶技术面临的问题第3页，共76页，2023年，2月20日，星期二反义核酸和反义技术反义核酸(antisensenucleicacid)

是一段与靶基因的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列

它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点反义核酸技术（antisensenucleicacidstechnology)

是根据核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的一类核酸研究新技术

包括反义RNA(asRNA)、反义DNA(asDNA)、核酶(Rz)第4页，共76页，2023年，2月20日，星期二反义核酸的基本原理绝大多数DNA由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸不同排列顺序编码在DNA链上，基因组形成单顺反子结构在DNA双链上被转录为RNA的链为正义链，与其相对应的链为反义链精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，一般由7到30个核苷酸组成，将会阻断基因转录；或将含有反义序列的载体导入细胞内，干扰特定基因表达利用这一原理可以在基因位点、前体mRNA、mRNA及蛋白水平，通过干扰特定基因功能限制细胞增殖、分化和凋亡第5页，共76页，2023年，2月20日，星期二反义基因治疗

DNADNA

RNARNA

反义RNA

阻断表达利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，控制细胞的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为mRNA或阻断翻译相应蛋白第6页，共76页，2023年，2月20日，星期二第7页，共76页，2023年，2月20日，星期二反义技术的两种技术路线将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内，使细胞表达与目标基因互补的mRNA，从而阻断目标基因的表达体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进入细胞，特异性地与目标mRNA作用以第二种为主来介绍第8页，共76页，2023年，2月20日，星期二反义核酸的种类反义RNA：一类能与特异mRNA互补的小分子质量的、可扩散的DNA转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异地抑制靶基因表达反义DNA：人工合成一小段反义寡核苷酸，与DNA或mRNA序列互补结合，封闭靶基因表达（ASODN）

理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象“封条”一样，阻断mRNA拼接、转录、翻译，下调特定基因表达第9页，共76页，2023年，2月20日，星期二反义RNA的最初发现反义RNA最先发现于原核细胞，是由Tomizarna在1981年对质粒ColE1复制的研究过程中发现的第10页，共76页，2023年，2月20日，星期二c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节c-myc基因是禽类髓细胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的细胞同源序列，与多种肿瘤发生发展有关Saito等研究发现，c-myc基因有3个外显子，第一个外显子不编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义RNA与第二个外显子mRNA的碱基配对而抑制基因表达在人Burkitt淋巴瘤中发现c-myc基因失去了第一个外显子，从而使c-myc基因表达失控由此可见，反义RNA的负调节被解除是细胞恶性转变的原因之一第11页，共76页，2023年，2月20日，星期二c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调节c-myc互补RNAC-MYC第12页，共76页，2023年，2月20日，星期二反义RNA的作用机制作用于外显子和内含子的连接区，阻止mRNA前体的剪接反义RNA与DNA结合时能阻止转录因子与DNA的结合，从而阻止特定基因的转录互补于特定mRNA的非编码区，如SD序列或核糖体结合位点及其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译互补于特定mRNA的编码区，抑制翻译或激活RNaseH使mRNA易被核酸酶降解作用于靶mRNA的5’端，阻止帽子结构形成，影响mRNA的成熟作用于PoIyA形成位点，阻止靶mRNA成熟及向胞浆内的转运第13页，共76页，2023年，2月20日，星期二反义RNA的作用机制DNApreRNARNAProteinm7G5'pppAA…AArRNA第14页，共76页，2023年，2月20日，星期二反义RNA的获得途径化学会成法：利用核酸合成仪直接合成反义RNA体外转录法：利用带有噬菌体SP6或T7等启动子序列的质粒，将特异基因的DNA片段反向插入其多克隆位点中，在RNA聚合酶的作用下体外合成特异性反义RNA细胞内转录法：利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义RNA表达载体(病毒表达载体或质粒表达载体)，然后转染细胞并使之在细胞中稳定表达反义RNA第15页，共76页，2023年，2月20日，星期二反义RNA的临床作用抗病毒：将特定的病毒基因反向插入到表达性载体中，以构建反义RNA表达载体再将重组体导入真核细胞(病毒宿主细胞)中表达特异性反义RNA从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒）抗肿瘤：设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及某些肿瘤相关病毒的癌基因反义RNA以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的第16页，共76页，2023年，2月20日，星期二反义DNA与靶基因结合形式寡核苷酸与双股DNA结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活转录蛋白与基因启动子结合，发挥其生物活性寡核苷酸与mRNA杂交形成了核糖核苷酸酶H(RNaseH)底物，激活RNaseH识别杂交体特异性地剪切杂交分子中的mRNARNaseHASODNmRNATFO第17页，共76页，2023年，2月20日，星期二反义寡聚核苷酸与mRNA特异性结合，阻断翻译过程第18页，共76页，2023年，2月20日，星期二ANTISENSETECHNOLOGIESGENOMICSBASEDDRUGDISCOVERYPHARMACEUTICALSMOLECULARDIAGNOSTICSGENETHERAPYDRUGDELIVERYSYSTEMSRelationofantisensetechnologiestoothersegmentsofbiopharmaceuticalindustry反义技术与反义核酸的应用第19页，共76页，2023年，2月20日，星期二利用反义RNA的原癌基因失活疗法：

阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体mRNA成熟原癌基因调控细胞生长，增殖与分化正常情况下，表达受严格控制一旦调节失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌治疗方法

根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义RNA

相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的mRNA的起始翻译位

点结合成RNA/RNA双链体

双链体阻止启动子与核糖体结合，或核糖体沿mRNA上移，抑制翻译反义RNA的应用（一）第20页，共76页，2023年，2月20日，星期二

反义RNA的应用（二）第21页，共76页，2023年，2月20日，星期二

反义RNA的应用（二）第22页，共76页，2023年，2月20日，星期二

反义RNA的应用（二）抗HIV-l的作用：从翻译水平封闭基因表达，并干扰mRNA的剪切、加工而实现抗病毒作用tat为HIV-l重要的调节基因，编码反式激活因子Tat蛋白在逆转录病毒启动子LTR之后连接反义tat与多聚TAR的构建物(LTR-25TAR-AS-TAT)，具有反义tat及TAR诱饵的双重作用由于LTR启动子受Tat蛋白反式激活，使tat在HIV-l感染的细胞中得以高表达将这种外源基因导入Molt-3T细胞系、CEM-SST细胞系及健康人外周血单个核细胞(PBMCs)，对实验及临床分离病毒株均有抑制作用gag是HIV-1的结构基因，编码p24等病毒结构蛋白Veres等构建了逆转录病毒载体，在细胞内表达互补于gag区不同长度的反义RNA(225-1225nt)

在CEM-SST细胞及外周血CD4细胞均有抑制HIV-l复制的作用长片段反义RNA的抗HIV-l作用更好，可能由于它能与不同种的HIV-lRNA结合而限制了病毒的逃逸第23页，共76页，2023年，2月20日，星期二部分反义药物第24页，共76页，2023年，2月20日，星期二OligoCompanyStatus/RemarksISIS3521ISIS2503ISIS5132AP12009OncomygNGAVI4557GenasenseGEM231GTI2040GTI2501LEafAONPAN346HERZYMEANGIOZYMEISISPharmaISISPharmaISISPharmaAntisensePharmaAVIBIoPharmaAVIBIoPharmaGentaHybridonLorusTherapeuticsLorusTherapeuticsNeoPharmPanaceaPharmaRibozymePharmaRibozymePharmaPIII(Affinitak)PIIIPIII针对肿瘤的反义药物第25页，共76页，2023年，2月20日，星期二针对其他疾病的反义药物OligoCompanyIndicationsRestenNGE2FDecoyAVIBioPharmaCorgentechCardiovasculardisorderISIS2302ISIS104838AVI4014ISISPharmaISISPharmaAVIBIoPharmaAutoimmune&InflammatoryDurasonEpiGenesisRespiratorydisorderAVI4126AVIBioPharmaUrologicalDiseaseISIS14803HEPTAZYMEHepBzymePNAbioticsNeuBioticsISISPharmaRibozymePharmaRibozymePharmaPanthecoAVIBiopharmaInfectiousDiseaseGEM92HGTV43HybridonEnzoAIDS&Relateddisease第26页，共76页，2023年，2月20日，星期二第一个反义药物——福米韦生Fomivirsen（ISIS2922）是FDA批准上市的第1个反义药物商品名Vitravene美国ISISPharma公司研制瑞士CibaVisionOphthalmics公司申请1998年8月在美国首次上市核苷酸序列为5’-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3’硫代磷酸化修饰主要用于治疗艾滋病(AIDS)病人并发的巨细胞病毒(CMV)性视网膜炎第27页，共76页，2023年，2月20日，星期二第一个反义药物——福米韦生1药效学1.1抗病毒作用机制主要依赖于反义作用，福米韦生与CMVmRNA特异序列互补结合，被RNA酶H识别，并使mRNA水解失活抑制CMV进入宿主细胞是序列非依赖性的非反义作用1.2抗病毒活性对人类CMV病毒株AD169的EC50为0.37μmoL此EC50为更昔洛韦（ganciclovir）的l30～1901.3耐药性耐受高浓度福米韦生的病毒突变株与福米韦生互补的基因区并无改变，这表明耐药性不是互补基因区发生改变而引起的第28页，共76页，2023年，2月20日，星期二第一个反义药物——福米韦生2药动学2.1兔体内药动学以14C标记的福米韦生单次66μg剂量，玻璃体液中消除t1/2为62h给药10天后，仍对CMV复制有抑制作用，有22%的福米韦生存在，其余78%则降解为短链代谢物视网膜中消除t1/2约为79h2.2猴体内药动学玻璃体液药物浓度与剂量曲线几乎为直线关系峰值浓度出现在给药2～3天后，14天后基本检测不到在每周或每2周玻璃体内注入11、57和115μg后，玻璃体液中未发现药物累积现象但多次注射后，视网膜上出现药物累积现象福米韦生115μg单次给药，在视网膜中消除t1/2为78h第29页，共76页，2023年，2月20日，星期二第一个反义药物——福米韦生3临床疗效前3周每周福米韦生165μg玻璃体内注射，以后每2周给药1次，用药组和对照组病情进展时间中位数分别为71和14天福米韦生可以降低病人体内的CMV活性，呈剂量-效应关系病情发展到威胁视力的病人，使用福米韦生后症状有所好转，病情进展明显延缓4不良反应最常见不良反应是暂时性眼内压升高和轻、中度眼前、后房炎症反应所有研究对象均未发生视网膜剥脱和全身毒性反应高剂量可引起少数病人外周视网膜色素沉着及周边视力下降与眼外科手术相比，玻璃体内注射发生出血、眼内炎和视网膜剥脱的风险要小得多第30页，共76页，2023年，2月20日，星期二第一个反义药物——福米韦生5适应证和禁忌证福米韦生为二线治疗药物，适用于对其他治疗措施不能耐受或没有效果或有禁忌的病人；禁用于2～4周内使用西多福韦（cidofovir）治疗的病人，以免增加发生眼内炎的危险性6与治疗CMV视网膜炎的其他药物比较更昔洛韦、西多福韦和膦甲酸钠是CMV抑制剂，而非杀死剂；具有交叉耐药性；可产生肾毒性；插管给药、植入制剂费用昂贵、重复手术以及视网膜剥脱发生率高（28%）使应用受限福米韦生具有阻止病毒复制，疗效持久、用药次数少，不良反应少而轻，局部玻璃体内注射给药优于其他上述提及的给药方法7展望第31页，共76页，2023年，2月20日，星期二受体介导的转移技术受体介导DNA转运技术的启发实现DNA和RNA的转运例：脱唾液酸血清类粘蛋白(ASGP)受体

唾液酸血清类粘蛋白—唾液酸→ASGP

ASGP

+PL（多聚赖氨酸）→

ASGP-PL复合物反义RNA

+ASGP-PL复合物→

ASGP-PL-反义RNA复合物

ASGP-PL-反义RNA复合物→

肝细胞表面ASGP受体识别→吞噬→

释放→发挥作用优点：专一性强，抗降解能力强第32页，共76页，2023年，2月20日，星期二以聚合物微球为载体的输送系统目前研究最多的聚合物微球是聚丙交酯及乳酸一羟乙酸（LA-GA）以丙交酯和乙交酯为单体形成的共聚物，降解属于水解反应产物均为人体正常代谢物，降解时间取决于两种单体的配比和聚合物的分子量构成的结合复合体具有潜在的转运反义核苷酸和核酶的作用第33页，共76页，2023年，2月20日，星期二核酶技术及其应用核酶(Ribozyme)——一种具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异性地切割靶RNA序列，具有解离后重复切割相同靶分子的能力第34页，共76页，2023年，2月20日，星期二核酶发展简史1968年，FrancisCrick在他的论文“基因密码的起源”一文中提到：“可能第一个酶是具有复制能力的RNA”，没有人予以注意1987年，第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上，AlanWeiner做会议总结时重复了20年前FrancisCrick的话，会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性RNA分子上1989年，诺贝尔化学奖授予了分别独立地发现具有酶活性的RNA分子的Thomas.R.Cech（ColoradoUniversity）SidneyAltman（YaleUniversity）第35页，共76页，2023年，2月20日，星期二ThomasR.Cech切赫，美国人因发现RNA生物催化作用与S.Altman同获1989年诺贝尔化学奖独立发现RNA不仅被动地传递遗传信息，还能催化细胞内生命所必需的化学反应，1982年公布其研究结果，1983年证实RNA的酶活动此前，人们认为仅蛋白质才能起酶的作用第36页，共76页，2023年，2月20日，星期二核酶的发现研究目的：rRNA中一些无意义的序列，或内含子(intron)，如何从RNA分子中剪切下来？研究对象：原生动物四膜虫(TetrahymenaThermophila)，只含一种RNA，除rRNA外还有一个由413个核苷酸组成的插入序列(interveningsequenc，IVS)研究发现：转录产物rRNA前体很不稳定，在鸟苷和Mg2+存在下切除自身的IVS，使两个外显子拼接起来，变成成熟的rRNA分子。催化反应是在无任何蛋白质酶存在下发生的，称为自我剪接研究结论：

IVS具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键rRNA前体能靠自己完成剪接过程，在一定条件下按一定方式盘绕，进而切割自己，以后再把保留部分连接起来。可以催化自由底物的具有酶活性的RNA

RNA分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即催化其他分子的反应第37页，共76页，2023年，2月20日，星期二SidneyAltman奥尔特曼（1939—）美国人因发现RNA的生物催化作用而获1989年诺贝尔化学奖1978年奥尔特曼发现了核糖核酸(RNA)自身具有的生物催化作用不仅为探索RNA的复制能力提供了线索，而且说明了最早的生命物质是同时具有生物催化功能和遗传功能的RNA，打破了蛋白质是生物起源的定论第38页，共76页，2023年，2月20日，星期二S.Altman的研究工作研究目的：t-RNA分子的剪接过程研究发现：在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核酸酶P（ribonucleaseP，RNaseP）中RNA能够切割tRNA前体5’端研究结论：过去都认为RNase

P的催化作用由RNA和蛋白质共同完成的，而该实验证明，RNase

P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用由于这类酶具有类似核糖核酸功能，而化学本质为核酸，因此被切赫称之为核酶第39页，共76页，2023年，2月20日，星期二核酶的作用机制第40页，共76页，2023年，2月20日，星期二核酶的分类剪切型核酶：这类核酶催化自身或者异体RNA的切割，相当于核酸内切酶剪接型核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性剪切型核酶剪接型核酶根据催化反应锤头核酶I型内含子II型内含子发夹核酶丁型肝炎病毒(HDV)核酶RNaseP链孢霉线粒体(VS)核酶自体催化异体催化第41页，共76页，2023年，2月20日，星期二自体剪切型核酶-锤头型核酶锤头核酶是从类病毒中分离出来的本来是一个顺式切割的酶，将其分为酶链和底物链两部分后就转变为靶标特异性的反式切割的酶在防止有害基因的表达上具有很大的应用价值形状：长约30个核苷酸，呈球状构象，可粗略看成性折叠二级结构：3个超螺旋结构域和13个保守核苷酸残基构成：催化区和底物结合区性质：需要二价金属离子(Mg2+)作为它的辅因子，核酶的活性形式是一种RNA键合金属氢氧化物第42页，共76页，2023年，2月20日，星期二3个双螺旋区13个核苷酸残基保守序列剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发生第43页，共76页，2023年，2月20日，星期二发夹结构核酶1989年汉普（Hample）研究烟草环斑病毒（sTRSV）的负链RNA的自我剪切反应，提出发夹结构（hairpinstructure）模型发夹核酶催化机制：金属离子在催化反应中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高第44页，共76页，2023年，2月20日，星期二5‘3‘剪切位点自体剪切型核酶-发夹结构3个环和4个螺旋形成两个结构域剪切反应发生在底物识别序列GUC的5‘端两个内部环中的碱基及在螺旋区II的G11和底物中的G+1都是酶发挥作用所必需的第45页，共76页，2023年，2月20日，星期二肝炎病毒（HDV）核酶目前唯一一种哺乳动物细胞内具有天然核酶活性的动物病毒来源于肝炎病毒的反义RNA和基因组RNA，为单股环状负链RNA病毒结构特点：有3个由碱基配对形成的茎，剪切时需要二价阳离子参与，结果产生5‘-OH和2’,3’-环磷酸第46页，共76页，2023年，2月20日，星期二剪切部位剪切部位自体剪切型核酶-斧头结构三个碱基对的茎需要二价阳离子产生5’-OH和2’,3’-环磷酸第47页，共76页，2023年，2月20日，星期二链孢霉线粒体（VS）核酶VS核酶球状，由5个螺旋结构组成，这些螺旋结构通过两个连接域连接起来，连接域对于催化反应很重要第48页，共76页，2023年，2月20日，星期二异体剪切型核酶－RNasePRNaseP是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH

和5’-磷酸末端RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成体外：M1RNA具催化作用，蛋白质作为辅助因子体内：M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的RNaseP可剪切前体5’端41nt,5’端成熟不同tRNA的5’端没有顺序共同性，剪切的准确性与剪切部位周围的核苷酸顺序无关，表明在RNaseP的组分内没有引导序列，RNaseP所识别的是底物的高级结构第49页，共76页，2023年，2月20日，星期二剪切位点第50页，共76页，2023年，2月20日，星期二G结合位点保守序列剪接部位引导序列G结合位点

I类内含子二级结构通式第51页，共76页，2023年，2月20日，星期二第52页，共76页，2023年，2月20日，星期二型内含子核酶一类具有酶催化功能的内含子，转录成RNA后，可以自剪接其转录后可形成9个碱基配对形成的特定二级结构，分别命名为P1至P9在剪接反应中，需要游离的鸟苷作辅助因子可以用来修复体内的有害突变基因第53页，共76页，2023年，2月20日，星期二I型内含子催化其他RNA分子反应的几种类型转核苷酸作用

2CpCpCpCpC

→CpCpCpCpCpC+CpCpCpC

水解作用

CpCpCpCpC

→CpCpCpC+pC

转磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpU→CpCpCpCpCpC+UpCpUp

去磷酸作用

CpCpCpCpCp

→CpCpCpCpC+Pi限制性内切酶作用̶CpUpCpUpN̶

+G→CpUpCpU+GpN̶第54页，共76页，2023年，2月20日，星期二II型内含子核酶由6个螺旋组成，分成3个部分：边界序列5’GUGCG···YnAG，（Y代表嘧啶，n代表任意核苷酸）3’茎环结构分支点顺序

A处于未配对状态，有一游离的2’-OH剪接机制：不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子(Mg2+)第55页，共76页，2023年，2月20日，星期二II型内含子核酶II型内含子有一个保守的二级结构结构域V：高度保守，催化活性必需结构域VI：未配对的A提供2‘-OH第56页，共76页，2023年，2月20日，星期二II型内含子核酶第57页，共76页，2023年，2月20日，星期二II型内含子核酶剪接机制第58页，共76页，2023年，2月20日，星期二第59页，共76页，2023年，2月20日，星期二脱氧核酶指具有催化功能的DNA分子称为脱氧核酶(DNAzyme)，又称酶性DNA在一定条件下可切割RNA分子特定位点内部的磷酸二酯键脱氧核酶的发现进一步延伸了酶的概念具有水解酶活性的脱氧核酶以RNA为底物的脱氧核酶：包括“10-23”DRz和“8-17”DRz

以DNA为底物的脱氧核酶：手枪型脱氧核酶具有N-糖基化酶活性的脱氧核酶具有连接酶活性的脱氧核酶具有激酶活性的脱氧核酶第60页，共76页，2023年，2月20日，星期二10-23型脱氧核酶作用机理第61页，共76页，2023年，2月20日，星期二手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理第62页，共76页，2023年，2月20日，星期二核酶与RNA修复核酶是天然的具有催化能力的RNA分子，能特异性地催化RNA剪接经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意给定的RNA分子剪接有两种形式：一是分子内不同部分间的剪接，称为顺式剪接；一是不同分子间的剪接，称为反式剪接反式剪接是修复RNA外显子突变的重要方法可以把正常基因或具有类似功能的基因相应片段，剪接到异常RNA上去，换下突变的部分第63页，共76页，2023年，2月20日，星期二修复RNA结构缺陷利用核酶的剪接能力，可引入新的基因功能或修复已有的基因缺陷N.Lan等对镰形细胞贫血突变的β珠蛋白mRNA进行了修复镰刀形细胞贫血是由于β珠蛋白基因第6密码子中的一个A→T突变引起的将来源于四膜虫组I内含子的核酶改造，使之能专一性识别β珠蛋白mRNA突变位点上游的特定序列将γ珠蛋白cDNA下游包括外显子在内的对应片段连接到这一核酶的3’端转染培养到病人外周血和脐带血干细胞后，均检测到β珠蛋白mRNA被剪接成β珠蛋白γ融合RNA分子，说明引入的功能基因得到表达第64页，共76页，2023年，2月20日，星期二第65页，共76页，2023年，2月20日，星期二胎儿型血红蛋白(HbF，α2γ2)与成人型血红蛋白(HbA，α2β2)功能相近，所以γ珠蛋白的引入，可以代偿βS珠蛋白所丧失的功能，起到治疗镰形细胞贫血的作用Tγγββ第66页，共76页，2023年，2月20日，星期二恢复正常剪接途径基因突变有时会在内含子中生成新的剪接点，当然也是异常的剪接点。它们与左邻右舍原来不起作用的隐匿的剪接点搭配起来，就会形成错误剪接由于原有的正常剪接点并未丧失功能，只是作用被异常剪接抑制，所以用反义核酸通过碱基互补，封闭异常剪接点或其他剪接元件，就可堵住异常剪接途径，迫使剪接系统选择正确的途径，形成正常RNA。这就间接地对RNA缺陷作了“修复”剪接缺陷型突变往往使mRNA失活，影响严重β地中海贫血是由于患者β珠蛋白基因突变，导致正常β链减少，红细胞内α和β链不平衡，缔合形成的成人型血红蛋白（α2β2）少了或者完全没有引起的已发现的190多种β地中海贫血突变型中，有一部分属于剪接缺陷型第67页，共76页，2023年，2月20日，星期二CCC—CCC—CCCC反义RNA第68页，共76页，2023年，2月20日，星期二β地中海贫血我国常见的内含子2第654位C→T突变（β654），就是在653位形成了一个新的剪接点，同时又激活了其上游579位一个潜在的剪接点，导致一段长度为73个碱基的内含子2序列插入到外显子2和3之间，形成异常mRNA，引起地中海贫血表型由于突变基因原有的正常剪接点并未遭到破坏，仍然可以发挥作用，所以用反义核酸封闭异常的653或579位点，就能迫使人体剪接系统回到正常剪接途径，减少异常mRNA的形成反义封闭虽没有对β珠蛋白基因的突变作任何修正，但是对突变RNA的错误剪接方式作了纠正，所产生的成熟mRNA可以指导合成正常珠蛋白链。第69页，共76页，2023年，2月20日，星期二调整蛋白质肽链比例

突变基因的异常表达，往往扰乱体内蛋白质肽链之间的平衡，引起疾病反义封闭技术也可用来纠正基因表达的紊乱。常见的血红蛋白H病（慢性溶血性贫血）的研究，就是一个比较理