第四讲发酵工艺控制

第四讲发酵工艺控制第1页，共125页，2023年，2月20日，星期二4.1发酵过程分类4.2发酵工艺控制温度控制

pH控制溶氧控制泡沫控制染菌控制提纲第2页，共125页，2023年，2月20日，星期二4.1发酵过程的分类

分批培养补料分批培养半连续培养连续培养第3页，共125页，2023年，2月20日，星期二典型的微生物生长曲线

初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累次级代谢产物，在对数生长期后期和稳定期大量合成第4页，共125页，2023年，2月20日，星期二4.1.1分批发酵

简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。分批培养的优缺点

优点:操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握缺点:产率低，不适于测定动力学数据第5页，共125页，2023年，2月20日，星期二4.1.2补料分批培养

在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。第6页，共125页，2023年，2月20日，星期二补料分批培养的优缺点优点:在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点:由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会.第7页，共125页，2023年，2月20日，星期二4.1.3半连续培养

在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液称为半连续培养。如四环素发酵；

优点:放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。

缺点:代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大第8页，共125页，2023年，2月20日，星期二4.1.4连续培养发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。第9页，共125页，2023年，2月20日，星期二连续培养的优缺点

优点:控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于μ＝D，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学；

缺点:若菌种不稳定，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。第10页，共125页，2023年，2月20日，星期二

发酵过程工艺控制目的

有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来，目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率；4.2发酵工艺控制发挥菌种的最大生产潜力考虑之点菌种本身的代谢特点生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率菌代谢与环境的相关性温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等第11页，共125页，2023年，2月20日，星期二发酵过程的中间分析

发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等第12页，共125页，2023年，2月20日，星期二参数分类按参数性质分：物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、尾气氧（二氧化碳）浓度等；化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等；生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等；第13页，共125页，2023年，2月20日，星期二按检测手段分：直接参数、间接参数直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参

数，如温度、pH、残糖等；分为在线

检测参数和离线检测参数；间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄

氧率、KLa等；第14页，共125页，2023年，2月20日，星期二4.2.1温度对发酵的影响及其控制

一、温度对生长的影响

不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0～26℃生长，嗜温菌适应于15～43℃生长，嗜热菌适应于37～65℃生长，嗜高温菌适应于65℃以上生长第15页，共125页，2023年，2月20日，星期二

每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征。在最适温度下，微生物生长迅速；超过最高温度微生物即受到抑制或死亡；在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。在最低和最高温度之间，微生物的生长速率随温度升高而增加，超过最适温度后，随温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。

微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。第16页，共125页，2023年，2月20日，星期二二、温度的影响与控制（一）温度对发酵的影响1、温度影响反应速率发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。从阿累尼乌斯方程式可以看到dlnKr/dt=E/RT2

积分得

E=E——活化能Kr——速率常数第17页，共125页，2023年，2月20日，星期二2、温度影响发酵方向

四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于300C时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到350C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。第18页，共125页，2023年，2月20日，星期二（二）最适温度的选择1、根据菌种及生长阶段选择

微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。黑曲霉生长温度为37℃，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30～32℃，青霉菌生长温度为30℃。第19页，共125页，2023年，2月20日，星期二

发酵前期由于菌量少，要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；

发酵中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。

发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段28℃，合成期260C℃后期再升温；黑曲霉生长37℃，产糖化酶32～34℃。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长30～32℃，产酸34～37℃。根据生长阶段选择第20页，共125页，2023年，2月20日，星期二实例：林可霉素发酵的变温培养

发酵现象接种后10h左右已进入对数生长期，随后是10h左右的加速生长期，在40h左右对数生长期基本完成，在50h左右转入生产期；主要问题

如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期？适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数量的有强生产能力的菌丝体存在！第21页，共125页，2023年，2月20日，星期二变温培养的正交设计第22页，共125页，2023年，2月20日，星期二第23页，共125页，2023年，2月20日，星期二分析结论：前60h按31℃控制，缩短了适应期使发酵提前转入生产阶段，同时菌丝体已有相当量的积累，为大量分泌抗生素提供了物质基础；60小时后将罐温降至3O℃使与抗生素合成有关的酶的活性增强，抗生素分泌量有所增加，同时因分泌期的延长有利于进一步积累抗生素；发酵进入后期罐温再回升至31℃使生产菌在生命的最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物。第24页，共125页，2023年，2月20日，星期二2、根据培养条件选择

温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。

通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。

培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。第25页，共125页，2023年，2月20日，星期二3、根据菌生长情况

菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。第26页，共125页，2023年，2月20日，星期二三、发酵过程引起温度变化的因素（一）发酵热Q发酵

发酵热：就是发酵过程中释放出来的净热量。发酵热=生物热＋机械搅拌热-罐壁散热-水分蒸发热-排气热；发酵热是引起发酵过程温度变化的原因：发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。第27页，共125页，2023年，2月20日，星期二1、生物热Q生物

在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。第28页，共125页，2023年，2月20日，星期二

生物热与发酵类型有关微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水好氧：产生287.2千焦耳热量，

183千焦耳转变为高能化合物

104.2千焦以热的形式释放厌氧：产生22.6千焦耳热量，

9.6千焦耳转变为高能化合物

13千焦以热的形式释放二个例子中转化为高能化合物分别为63.7％和42.6％第29页，共125页，2023年，2月20日，星期二

培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性生物的大小与呼吸作用强弱有关在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大。第30页，共125页，2023年，2月20日，星期二根据化合物的燃烧值估算发酵过程生物热的近似值。因为热效应决定于系统的初态和终态，而与变化途径无关，反应的热效应可以用燃烧值来计算，特别是有机化合物，燃烧热可以直接测定。反应热效应等于反应物的燃烧热总和减去生成物的燃烧热的总和。ΔH＝∑（△H）反应物－∑（△H）产物如谷氨酸发酵中主要物质的燃烧热为：葡萄糖159555.9KJ/Kg谷氨酸15449.3KJ/Kg玉米浆12309.2KJ/Kg菌体20934KJ/Kg尿素10634.5KJ/Kg生物热的测定与计算第31页，共125页，2023年，2月20日，星期二可根据实测发酵过程中物质平衡计算生物热例如某味精厂50M3发酵罐发酵过程测定结果的主要物质变化如表：发酵时间（h）0～66～1212～1818～31葡萄糖－37－30.3－24.0－41.7谷氨酸5.915.423.9尿素－2.9－6.0菌体4.86.01.2玉米浆－2.4－3.0－0.6第32页，共125页，2023年，2月20日，星期二发酵12～18小时的生物热为：Q生物＝24×159555.9＋0.6×12309.2＋6×10634.5－1.2×20934－15.4×15449.3＝191098.1KJ/M3191098.1÷6＝31849.7每小时的生物热为31849.7KJ/M3第33页，共125页，2023年，2月20日，星期二2、搅拌热Q搅拌在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：

Q搅拌＝P×860×4186.8（焦耳/小时）

P——搅拌轴功率

4186.8——机械能转变为热能的热功当量电机功率P=E——额定电压I——额定电流cosφ——功率因素，1千瓦时＝860×4186.8焦耳第34页，共125页，2023年，2月20日，星期二3、蒸发热Q蒸发

通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热Q显热，显热很小，一般可以忽略不计。4、辐射热Q辐射发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5％。Q发酵＝Q生物＋Q搅拌－Q蒸发－Q辐射第35页，共125页，2023年，2月20日，星期二（二）发酵热的测定

一种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。Q发酵＝GCm(T出－T进)Cm——水的比热G——冷却水流量

另一种是根据罐温上升速率来计算。先自控，让发酵液达到某一温度，然后停止加热或冷却，使罐温自然上升或下降，根据罐温变化的速率计算出发酵热。第36页，共125页，2023年，2月20日，星期二四、利用温度控制提高产量例1：利用热冲击处理技术提高发酵甘油的产量背景：（1）酵母在比常规发酵温度髙10～200C的温度下经受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。（2）Lewis发现热冲击能提高细胞对盐渗透压的耐受力。（3）Toshiro发现热冲击可使胞内3－磷酸甘油脱氢酶的活力提高15～25％，并导致甘油产量提高。第37页，共125页，2023年，2月20日，星期二实验：甘油发酵是在髙渗透压环境中进行的，因此可望通过热冲击来提高发酵甘油的产量正交条件A冲击温度（℃）40，45，50B开始时机（h）8，16，30C冲击时间（分）15，30，60结果发酵16小时，45℃冲击30分钟最佳，发酵96小时后甘油浓度提高32.6％，发酵罐实验见图（A）16h,45℃,30min（B）12h,45℃,30min第38页，共125页，2023年，2月20日，星期二A温度；B开始时机；C冲击时间第39页，共125页，2023年，2月20日，星期二第40页，共125页，2023年，2月20日，星期二A比B好第41页，共125页，2023年，2月20日，星期二例2：重组大肠杆菌人Cu/Zn-SOD的高表达Lac启动子，用乳糖作诱导剂

27℃30℃34℃37℃SOD49661427065904638比活8101471679526蛋白6.1299.709.7911.88OD6007.41

10.72

11.7824.77第42页，共125页，2023年，2月20日，星期二原因分析：1、乳糖被用于合成菌体和其它蛋白，减少了合成SOD

的原料，随着温度升高，蛋白和菌浓都增加；2、高温下可能SOD降解速率增加，杂蛋白增加；3、低温下由于比生长速率低，质粒脱落减少；4、低温下菌的衰老减缓，死亡率低；第43页，共125页，2023年，2月20日，星期二4.2.2发酵过程的pH控制

pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。

发酵过程中pH是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否第44页，共125页，2023年，2月20日，星期二一、发酵过程pH变化的原因

1、基质代谢

（1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降；糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一（2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降第45页，共125页，2023年，2月20日，星期二2、产物形成

某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。

3、菌体自溶

pH上升，发酵后期，pH上升。

第46页，共125页，2023年，2月20日，星期二二、pH对发酵的影响

林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不及时补糖、(NH4)2SO4或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上至115小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3，调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵单位。

1、实例1：pH对林可霉素发酵的影响

第47页，共125页，2023年，2月20日，星期二pH7.0t不调pH调pH效价pH

pH对林可霉素发酵的影响

第48页，共125页，2023年，2月20日，星期二例2：培养基初始pH值对漆酶分泌的影响pH在4～7范围内产酶最高第49页，共125页，2023年，2月20日，星期二2、pH对发酵的影响

（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻；（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行

（3）pH值影响培养基成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用

第50页，共125页，2023年，2月20日，星期二（4）pH影响代谢方向

pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH2~3时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。第51页，共125页，2023年，2月20日，星期二3、pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响

生长合成pH对菌体生长影响比产物合成影响小青霉素：菌体生长最适pH3.5~6.0，产物合成最适pH7.2~7.4

四环素：菌体生长最适pH6.0~6.8，产物合成最适pH5.8~6.0XpH四环素第52页，共125页，2023年，2月20日，星期二4、最佳pH的确定

配制不同初始pH的培养基，通过摇瓶考察发酵情况pH对产海藻酸裂解酶的影响第53页，共125页，2023年，2月20日，星期二pH对海藻糖水解酶产生的影响第54页，共125页，2023年，2月20日，星期二pH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响第55页，共125页，2023年，2月20日，星期二三、pH的控制

1、调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.5~6.82、在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3

，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等第56页，共125页，2023年，2月20日，星期二

在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料，在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH：如（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH

（2）当NH2-N低，pH低时补氨水；当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO44、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH

3、通过补料调节pH

第57页，共125页，2023年，2月20日，星期二

分别在4种缓冲介质中，于pH6．50一9．50测定天冬酰胺酶酶活力．1甘氨酸介质pH8.00时酶活力最高；2硼酸在pH8．50，酶反应最快3磷酸在pH8．50，酶反应最快4Tris在pH8．50，酶反应最快酶活1＞2＞4＞35、不同调pH方法的影响天冬酰胺酶第58页，共125页，2023年，2月20日，星期二

不同pH控制方式对目的突变株ISw330异亮氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。“1”表示只加CaC03控制pH值，“2”表示只加尿素控制，“3”表示CaC03和尿素联合控制pH值。异亮氨酸发酵第59页，共125页，2023年，2月20日，星期二例：pH对L-异亮氨酸发酵的影响菌株最适生长pH控制在6.8～7.06、发酵的不同阶段采取不同的pH值第60页，共125页，2023年，2月20日，星期二

不同pH值对菌体的形态影响很大，当pH值高于7．5时，菌体易于老化，呈现球状；当pH值低于6．5时菌体同样受抑制，易于老化。而在7．2左右时，菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在6．9左右时，菌体处于生长期，呈“八”字形状并占有绝对的优势。第61页，共125页，2023年，2月20日，星期二第62页，共125页，2023年，2月20日，星期二

采用阶段pH控制模式进行发酵，在发酵中前期控制pH6.9，到48h后pH值为7.15，到80h后pH值为7.25。产率22.27g·/L，产酸率提高12.23％。第63页，共125页，2023年，2月20日，星期二pH对发酵的影响pH影响酶的活性pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变pH值影响培养基成分和中间代谢物的解离pH影响代谢方向pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响

第64页，共125页，2023年，2月20日，星期二pH的控制方式基础培养基调节pH在基础料中加入维持pH的物质通过补料调节pH，补料与调pH矛盾时，加酸碱调pH

发酵的不同阶段采取不同的pH值选择合适的pH调节剂第65页，共125页，2023年，2月20日，星期二

溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。

在28℃氧在发酵液中的100％的空气饱和浓度只有0.25mmol.L-1左右，比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100％空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几分钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素。4.2.3氧的供需及对发酵的影响第66页，共125页，2023年，2月20日，星期二4.2.3.1微生物对氧的需求一、描述微生物需氧的物理量比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气，mmolO2·g菌-1·h-1

摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1

。r=QO2.X第67页，共125页，2023年，2月20日，星期二二、溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响CCrQO2CLCCr:

临界溶氧浓度,指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。第68页，共125页，2023年，2月20日，星期二一般对于微生物：CCr:

＝1～15%饱和浓度例：酵母4.6*10-3mmol.L-1,1.8%

产黄青霉2.2*10-2mmol.L-1,8.8%定义：氧饱和度＝发酵液中氧的浓度/临界溶氧浓度所以对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度>1.第69页，共125页，2023年，2月20日，星期二问题：一般微生物的临界溶氧浓度很小，发酵过程中氧是

否很容易满足呢？例：以微生物的摄氧率0.052mmolO2·L-1·S-1

计，而28℃氧在发酵液中的100％的空气饱和浓度只有0.25mmol.L-1左右，故该氧气浓度能满足微生物生存时间为：

0.25/0.052=4.8秒注意：由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样：

头孢菌素卷须霉素生长5%13%产物>13%>8%第70页，共125页，2023年，2月20日，星期二三、影响溶氧的因素r=QO2.X

菌体浓度QO2

遗传因素

菌龄

营养的成分与浓度

有害物质的积累

培养条件第71页，共125页，2023年，2月20日，星期二4.2.3.2发酵罐中氧的传递一、发酵液中氧的传递方程CCiPPi气膜液膜N：传氧速率kmol/m2.hkg:气膜传质系数kmol/m2.h.atmKl:液膜传质系数m/h第72页，共125页，2023年，2月20日，星期二C*＝P/H,与气相中氧分压相平衡的液体中氧的浓度Kl:以氧浓度为推动力的总传递系数(m/h)再令：单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为a(m2/m3)Nv：体积传氧速率kmol/m3.hKla:以(C*-C)为推动力的体积溶氧系数h-1第73页，共125页，2023年，2月20日，星期二二、发酵液中氧的平衡发酵液中供氧和需氧始终处于一个动态的平衡中传递：消耗：r=QO2.X氧的平衡最终反映在发酵液中氧的浓度上面第74页，共125页，2023年，2月20日，星期二三、供氧的调节C有一定的工艺要求，所以可以通过Kla和C*来调节其中C*＝P/HNvHPKla第75页，共125页，2023年，2月20日，星期二调节Kla是最常用的方法，kla反映了设备的供氧能力，一般来讲大罐比小罐要好。

45升1吨10吨搅拌速度250rpm120120供氧速率7.610.720.1第76页，共125页，2023年，2月20日，星期二4.2.3.3影响Kla的因素

Kla反映了设备的供氧能力，发酵常用的设备为摇瓶与发酵罐。一、影响摇瓶kla的因素为装液量和摇瓶机的种类摇瓶机往复，频率80-120分/次，振幅8cm旋转，偏心距25、12,转速250rpm第77页，共125页，2023年，2月20日，星期二装液量，一般取1/10左右：

250ml15-25ml500ml30ml750ml80ml例：

500ml摇瓶中生产蛋白酶，考察装液量对酶活的影响装液量30ml60ml90ml120ml

酶活力71373425392第78页，共125页，2023年，2月20日，星期二二、发酵罐中

Kla影响因素第79页，共125页，2023年，2月20日，星期二已知在通风发酵罐中，全挡板条件下：第80页，共125页，2023年，2月20日，星期二1、理论上分析KLand通气量提高搅拌速度，提高kla的效果显著第81页，共125页，2023年，2月20日，星期二例:某一产品的发酵

dnp0/vc产量

4501801.6220%49784502802.1240%55645501802.6160%8455例:黑曲霉生产糖化酶

n230230270

通气比1:0.81:1.21:0.8

产量181224162846提高d、n显著提高C,提高了产量提高N,比提高Q有效第82页，共125页，2023年，2月20日，星期二2、实际上：对于转速的调节有时是有限度的

通风的增加也是有限的

蒸发量大

中间挥发性代谢产物带走第83页，共125页，2023年，2月20日，星期二例：红曲霉生产色素用于食品工业，静止培养改为通气培养，比色法测定产量：通气静止1.42.03.16.819.5OD0.280.78.315.614.36.2提高下降所以这些因素的存在，发酵设备的供养是有限的第84页，共125页，2023年，2月20日，星期二3、小型发酵罐和大型发酵罐调节kla的特点

小型发酵罐，转速可调

大型发酵罐，转速往往不可调

大型反应器的合理设计

对现有设备一定要注意工艺配套第85页，共125页，2023年，2月20日，星期二4、影响Kla的其它因素

空气分布器：不同的形式影响Kla

液体的粘度：高粘度发酵的难度第86页，共125页，2023年，2月20日，星期二1、亚硫酸盐法（冷模）氧→亚硫酸钠的氧化Kla.C*=亚硫酸浓度的降低Cu2+

2Na2SO3+O2→2Na2SO44.2.3.4Kla的测定第87页，共125页，2023年，2月20日，星期二2、平衡法

rKla=————C*-CL例：一个装料为7L的实验室小罐，通气量为1VVM（标态），发酵液的CL＝25%、空气进入时的氧含量为21%，废气排出的氧含量为19.8%，求此时菌体的摄氧率和发酵罐的Kla。第88页，共125页，2023年，2月20日，星期二3、动态法

不同的测定方法得出的kla是不一样的第89页，共125页，2023年，2月20日，星期二4.2.3.5溶氧浓度的变化及其控制一、典型的分批发酵中氧浓度的变化规律（一定Kla下）：rXQCL一般有一个低谷，在对数生长的末期第90页，共125页，2023年，2月20日，星期二发酵过程的控制一般策略：前期有利于菌体生长，中后期有利用产物的合成溶氧控制的一般策略：前期大于临溶氧浓度，中后期满足产物的形成。二、发酵过程中溶氧的控制1、溶氧控制的策略第91页，共125页，2023年，2月20日，星期二2、溶氧控制的实例GAXDO谷氨酸发酵：要求：氧饱和度>1控制：0-12小时小通风

12小时后增加通风原因：0-12小时菌体量较小，采用小通风12第92页，共125页，2023年，2月20日，星期二

一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。例：生产肌苷酸：通气量不变17.15mg/ml24小时增加22.55mg/ml30小时增加18.25mg/ml36小时增加12.34mg/ml第93页，共125页，2023年，2月20日，星期二4.2.4发酵过程泡沫的形成与控制一、泡沫形成的基本理论泡沫的定义：一般来说：泡沫是气体在液体中的粗分散体，属于气液非均相体系美国道康宁公司对泡沫这样定义：体积密度接近气体，而不接近液体的“气/液”分散体。第94页，共125页，2023年，2月20日，星期二（一）泡沫形成的原因1、气液接触

因为泡沫是气体在液体中的粗分散体，产生泡沫的首要条件是气体和液体发生接触。而且只有气体与液体连续、充分地接触才会产生过量的泡沫。气液接触大致有以下两类情况：（1）气体从外部进入液体，如搅拌液体时混入气体（2）气体从液体内部产生。气体从液体内部产生时，形成的泡沫一般气泡较小、较稳定。第95页，共125页，2023年，2月20日，星期二2、含助泡剂

在未加助泡剂，但并不纯净的水中产生的泡沫，其寿命在0.5秒之内，只能瞬间存在。摇荡纯溶剂不起泡，如蒸馏水，只有摇荡某种溶液才会起泡。在纯净的气体、纯净的液体之外，必须存在第三种物质，才能产生气泡。对纯净液体来说，这第三种物质是助泡剂。当形成气泡时，液体中出现气液界面，这些助泡剂就会形成定向吸附层。与液体亲和性弱的一端朝着气泡内部，与液体亲和性强的一端伸向液相，这样的定向吸附层起到稳定泡沫的作用。第96页，共125页，2023年，2月20日，星期二3、发酵过程泡沫产生的原因（1）通气搅拌的强烈程度通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。应先开小通气量，再逐步加大。搅拌转速也如此。也可在基础料中加入消泡剂。第97页，共125页，2023年，2月20日，星期二（2）培养基配比与原料组成因素培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，搅拌速度就不能太快。例：在50L罐中投料10L，成分为淀粉水解糖、豆饼水解液、玉米浆等，搅拌900rpm，通气，泡沫生成量为稀培养基的2倍。

第98页，共125页，2023年，2月20日，星期二（3）菌种、种子质量和接种量菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量

（4）灭菌质量培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。第99页，共125页，2023年，2月20日，星期二（二）起泡的危害1、降低生产能力在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量2、引起原料浪费如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。

第100页，共125页，2023年，2月20日，星期二3、影响菌的呼吸

如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满二氧化碳，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸。4、引起染菌由于泡沫增多而引起逃液，于是在排气管中粘上培养基，就会长菌。随着时间延长，杂菌会长入发酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封，轴封处的润滑油可起点消泡作用，从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染。第101页，共125页，2023年，2月20日，星期二1、常用消泡剂的种类和性能（1）天然油脂

天然油脂是最早用的消泡剂，如豆油、菜油、鱼油等。油脂主要成分是高级脂肪酸酯和高级一元醇酯，还有高级醇、高级烃等。但油脂如保藏不好，易变质，使酸值增高，对发酵有毒性。此外，有些油是发酵产物的前体，如豆油是红霉素的前体，鱼油是螺旋霉素的前体。近年来出于对环境保护的重视，天然产物消泡剂的地位又有些提高，而且还在研究新的天然消泡剂；二、泡沫的控制（一）、消泡剂消泡第102页，共125页，2023年，2月20日，星期二（2）聚醚类消泡剂

聚醚类消泡剂种类很多我国常用的主要是甘油三羟基聚醚。它是以甘油为起始剂，由环氧丙烷，或环氧乙烷与环氧丙烷的混合物进行加成聚合而制成的。在甘油分子上加成聚合环氧丙烷的产物叫聚氧丙烯甘油定名为GP型消泡剂；用于链霉素发酵，代替天然油，加入基础料，效果很好。在GP型消泡剂的聚丙二醇链节末端再加成环氧乙烷，成为链端是亲水基的聚氧乙烯氧丙烯甘油，也叫GPE型消泡剂（泡敌）。按照环氧乙烷加成量为10%，20%，……50%分别称为GPE10，GPE20，……GPE50。这类消泡剂称为“泡敌”。用于四环素发酵效果很好，相当于豆油的10~20倍。第103页，共125页，2023年，2月20日，星期二GP型的消泡剂亲水性差，在发泡介质中的溶解度小，所以宜使用在稀薄的发酵液中。它的抑泡能力比消泡能力优越，适宜在基础培养基中加入，以抑制整个发酵过程的泡沫产生。

GPE型消泡剂亲水性较好，在发泡介质中易铺展，消泡能力强，但溶解度也较大，消泡活性维持时间短，因此用在粘稠发酵液中效果较好。

GPES型消泡剂：在GPE型消泡剂链端用疏水基硬脂酸酯封头，便形成两端是疏水链，当中间隔有亲水链的嵌段共聚物。这种结构的分子易于平卧状聚集在气液界面，因而表面活性强，消泡效率高。第104页，共125页，2023年，2月20日，星期二（3）高碳醇高碳醇是强疏水弱亲水的线型分子，在水体系里是有效的消泡剂。七十年代初前苏联学者在阴离子、阳离子、非离子型表面活性剂的水溶液中试验，提出醇的消泡作用，与其在起泡液中的溶解度及扩散程度有关。

C7~C9的醇是最有效的消泡剂。

C12~C22的高碳醇借助适当的乳化剂配制成粒度为4~9μm，含量为20~50%的水乳液，即是水体系的消泡剂。苯乙醇油酸酯、苯乙酸月桂醇酯等在青霉素发酵中具有消泡作用，后者还可作为前体。第105页，共125页，2023年，2月20日，星期二（4）硅酮类

最常用的是聚二甲基硅氧烷，也称二甲基硅油。它表面能低，表面张力也较低，在水及一般油中的溶解度低且活性高。

也有在硅油和SiO2气溶胶的复合物中添加一种或两种乳化剂，加热溶匀，与增稠剂水溶液混合后乳化。增稠剂有羧甲基纤维素钠盐。这类消泡剂广泛用于抗生素发酵及食品工业。值得注意的是：消泡剂有选择性。消泡剂用多了有毒性，而且还影响通气和气体分散，因此要少量地加。第106页，共125页，2023年，2月20日，星期二一、染菌的影响

发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤。造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失扰乱生产秩序，破坏生产计划。遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。影响产品外观及内在质量4.2.5染菌的防治第107页，共125页，2023年，2月20日，星期二（一）染菌对发酵的影响生产不同的品种，可污染不同种类和性质的微生物。不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量，不同培养基和培养条件又可产生不同后果第108页，共125页，2023年，2月20日，星期二

疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。热源问题不同产品第109页，共125页，2023年，2月20日，星期二2、污染不同种类和性质微生物的影响（1）污染噬菌体（2）污染其他杂菌：如耐热芽孢杆菌第110页，共125页，2023年，2月20日，星期二3、不同时间染菌对发酵的影响

污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量有关。污染的菌量多，显现染菌所需的时间就短，污染菌量少，显现染菌的时间就长。第111页，共125页，2023年，2月20日，星期二（1）种子培养期染菌

由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。第112页，共125页，2023年，2月20日，星期二（2）发酵前期染菌发酵前期最易染菌，且危害最大。原因：发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。染菌措施：可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。第113页，共125页，2023年，2月20日，星期二（3）发酵中期染菌

发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施：降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。第114页，共125页，2023年，2月20日，星期二（4）发酵后期染菌

发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。第115页，共125页，2023年，2月20日，星期二（二）发酵染菌对提炼和产品质量的影响1、发酵染菌对过滤的影响染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致过滤困难。即使采取加热、冷却、添加助滤剂等措施，使部分蛋白质凝聚，但效果并不理想。2、发酵染菌对提炼的影响第116页，共125页，2023年，2月20日，星期二二、染菌原因

造成染菌的因素很多，但总结几十年的经验，对绝大部分罐批染菌的原因是比较清楚的，但在实际生产中发酵染菌率仍比较高，可以说产生这种现象大多数是由于工作中“明知故犯”“不负责任”和“侥幸心理”所造成的。例如，灭菌的蒸汽压不足不能灭菌；设备有渗漏不能进罐等等都是众所周知的，但因为有侥幸心理还是照样灭菌，进罐，结果以污染杂菌而告终。现将我们收集到的国内外几家抗生素工厂发酵染菌原因列于下：第117页，共125页，2023年，2月20日，星期二日本发酵研究所抗生素发酵染菌原因分析原因概率，%种子带菌9.64接种时罐压跌零