第四章原核基因表达调控模式

第四章原核基因表达调控模式zxk@xiaofuzhou@第1页，共63页，2023年，2月20日，星期二原核生物细胞的基因和蛋白质种类较少，如大肠杆菌基因组约为4.20×106bp共有4288个开放读码框（表6-1）。据估计，一个细胞中总共含有107个蛋白质分子。第2页，共63页，2023年，2月20日，星期二第3页，共63页，2023年，2月20日，星期二每个大肠杆菌细胞有约15000个核糖体，50种核糖体蛋白、糖酵解体系的酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代谢过程中必需的，其合成速率不受环境变化或代谢状态的影响，这一类蛋白质被称为永久型（constitutive）合成的蛋白质。第4页，共63页，2023年，2月20日，星期二另一类则被称为适应型或调节型（adaptiveorregulated），因为这类蛋白质的合成速率明显地受环境的影响而改变。如大肠杆菌细胞中一般只有15个β-半乳糖苷酶，但若将细胞培养在只含乳糖的培养基中，每细胞中这个酶的量可高达几万个分子。第5页，共63页，2023年，2月20日，星期二补一第三章原核基因表达调控模式.ppt第6页，共63页，2023年，2月20日，星期二3.1原核基因表达调控总论随着生物个体的发育，DNA分子能有序地将其所承载的遗传信息，通过密码子-反密码子系统转变成蛋白质，执行各种生理生化功能。科学家把从DNA到蛋白质的过程称为基因表达（geneexpression），对这个过程的调节就称为基因表达调控（generegulation或genecontrol）。第7页，共63页，2023年，2月20日，星期二第8页，共63页，2023年，2月20日，星期二基因表达(geneexpression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。rRNA或tRNA的基因经转录和转录后加工产生成熟的rRNA或tRNA,也是rRNA或tRNA的基因表达，因为rRNA或tRNA就具有在蛋白质翻译方面的功能。第9页，共63页，2023年，2月20日，星期二基因表达的时间性及空间性1时间特异性按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，这是基因表达的时间特异性。多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性。2空间特异性在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，这就是基因表达的空间特异性。又称细胞特异性或组织特异性。第10页，共63页，2023年，2月20日，星期二基因表达的方式1组成性表达某些基因产物对生命全过程是必需的或必不可少的。这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因。管家基因较少受环境因素影响，在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达，或变化很小。2诱导和阻遏表达与管家基因不同，有一些基因表达极易受环境变化影响。在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因是可诱导的，称为诱导。相反，如果基因对环境信号应答时被抑制，基因表达产物水平降低的，称为阻遏。诱导和阻遏是同一事物的两种表现形式，在生物界普遍存在，也是生物体适应环境的基本途径。第11页，共63页，2023年，2月20日，星期二基因表达调控主要表现在以下二方面：转录水平上的调控(transcriptionalregulation)；转录后水平上的调控(post-transcriptionalregulation)，包括:（1）mRNA加工成熟水平调控（differentialprocessingofRNAtranscrpt）；（2）翻译水平调控（differentialtranslationofmRNA）。第12页，共63页，2023年，2月20日，星期二细菌的转录与翻译过程几乎发生在同一时间间隔内，转录与翻译相耦联（coupledtranscriptionandtranslation）。真核生物中，转录产物（primarytranscript）只有从核内运转到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质（图6-2）。第13页，共63页，2023年，2月20日，星期二第14页，共63页，2023年，2月20日，星期二原核生物的基因调控主要是转录调控，包括负转录调控和正转录调控。在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），阻止结构基因转录。根据其作用特征又分为负控诱导和负控阻遏二大类。第15页，共63页，2023年，2月20日，星期二在负控诱导系统中，阻遏蛋白不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录；在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。阻遏蛋白作用于操纵区。第16页，共63页，2023年，2月20日，星期二在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator）。根据其作用特性分为正控诱导系统和正控阻遏系统。在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态；在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态（图6-3，表6-2）。第17页，共63页，2023年，2月20日，星期二第18页，共63页，2023年，2月20日，星期二为了区分调控过程中的调控成分和其调控的基因，又使用结构基因(Structuralgene)和调控基因(Regulatorgene)的概念。结构基因是编码蛋白质或RNA的任何基因。结构基因编码大量结构和功能各异的蛋白质，包括结构蛋白、具有催化活性的酶和调控蛋白。调控基因是参与其它基因表达调控的蛋白质的结构基因。第19页，共63页，2023年，2月20日，星期二调控的关键是调控基因编码的蛋白质通过与DNA上的特异位点的结合来调控转录。这种相互作用可以通过正(Positive)调控的方式(打开基因的作用)和负(Negative)调控的形式(关闭基因的作用)来调控一个靶基因(Targetgene)。第20页，共63页，2023年，2月20日，星期二细菌中对于转录调控的最初概念是1961年由Jacob和Monod以关于基因表达调控的模型这一经典的形式提出的。它们将DNA序列分成两种类型：编码反式作用因子(trans-actingfactor)的序列和功能严格限制在DNA内部的顺式作用元件(cis-actingelement)。基因的活性调控主要通过反式作用因子(通常是蛋白质)和顺式作用元件(通常在DNA

上)的特异性相互作用而实现的。第21页，共63页，2023年，2月20日，星期二更多的正式术语：基因是编码可扩散产物的DNA序列，这种产物可以是蛋白质(大多数基因都编码蛋白质)，也可以是RNA(tRNA和rRNA)。最重要的特点是基因产物将从合成的场所扩散到其发挥作用的场所。游离基因产物扩散至其目标场所的过程称为反式作用(trans-acting)。顺式作用(cis-acting)的概念用于任一不转变为任何其它形式的DNA序列，它只在原位发挥DNA序列的作用，仅影响与其在物理上相连的DNA(有时顺式调控序列最终发挥作用的分子不是DNA，而是RNA)。第22页，共63页，2023年，2月20日，星期二细菌的传统控制机制是负调控：阻遏蛋白阻止基因表达。RNA聚合酶能够识别它的启动子，使这种基因得到表达。与启动子相邻的另一个顺式作用位点称为操纵基因(Operator)，它是阻遏蛋白的靶位点。当阻遏蛋白和操纵基因结合时，就会阻止RNA聚合酶启动转录，基因的表达因而被关闭。图示：在负调控中，反式阻遏蛋白结合到顺式作用的操纵子上，从而关闭了转录。原核生物中多个基因调控是协同进行的。第23页，共63页，2023年，2月20日，星期二图示：在正调控中，为了能使RNA聚合酶在启动子处起始转录，反式作用因子必须与顺式作用元件结合。在真核生物中，各个结构基因是单独调控的。除了负调控，还有正调控。在细菌中，正调控和负调控使用的频率也许大致相等。但在真核生物中，最常见的调控方式是正调控。真核的基因不具活性：RNA聚合酶不能在启动子处单独开始转录。反式作用因子在启动子附近有作用位点，其中的一些或所有因子的结合使RNA聚合酶能起始转录。第24页，共63页，2023年，2月20日，星期二正调控和负调控的共同点是调控蛋白(Regulatoryprotein)都是反式作用因子，它通常识别位于基因上游的顺式作用元件。这种识别的结果是根据调控蛋白的类型决定的，激活(Activate)或阻遏(Repress)基因的表达。尽管调控蛋白结合DNA的实际长度较长，但它仅识别DNA上很短的序列，一般小于10bp。细菌的启动子就是一个例子：虽然RNA聚合酶在转录起始时，覆盖大于70bp的DNA，但其识别的关键序列是位于-35和-10中心处6个碱基的序列。第25页，共63页，2023年，2月20日，星期二原核生物和真核生物的基因的组织形式差异很大，细菌的结构基因一般成簇(Cluster)排列，而真核生物的基因则是独立存在。成簇排列的结构基因能受单一启动子共同控制：结果使整套基因或者表达或者都不表达。第26页，共63页，2023年，2月20日，星期二6.2.1酶的诱导—lac体系受调控的证据

一般情况下，lac+基因型大肠杆菌细胞内β-半乳糖苷酶和透过酶的浓度很低，每个细胞只有1～2个酶分子。但是，在乳糖培养基上酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，超过105个酶分子/细胞。第27页，共63页，2023年，2月20日，星期二在无葡萄糖有乳糖的培养基中，lac+细菌中将同时合成β-半乳糖苷酶和透过酶。用32P标记的mRNA与模板DNA进行定量分子杂交，表明培养基中加入乳糖1～2分钟后，编码β-半乳糖苷酶和透过酶的lacmRNA量就迅速增加，去掉乳糖后，lacmRNA量立即下降。第28页，共63页，2023年，2月20日，星期二第29页，共63页，2023年，2月20日，星期二3.2.2操纵子模型及其影响因子1961年Jacob和Monod认为诱导酶（他们当时称为适应酶）现象是个基因调控问题，而且可以用实验方法进行研究，他们通过大量实验及分析，建立了现在已经被人们广泛接受的乳糖操纵子的控制模型。第30页，共63页，2023年，2月20日，星期二乳糖操纵子控制模型的主要内容：包括结构基因和控制其表达的整个系统形成一个调控单位称为操纵子(Operator)。操纵子的活性是由调控基因控制的，其蛋白产物和顺式作用调控元件相互作用。根据对突变的影响来区分结构基因和调控基因。结构基因突变只引起其编码的特定蛋白质失活。调控基因的突变则影响其控制的所有结构基因的表达。调控基因的突变揭示了调控的类型。lacZYA基因的转录受lacI基因指导合成的调控蛋白控制.第31页，共63页，2023年，2月20日，星期二图.乳糖操纵子长约为6000bp。左端的LacI基因有它自己的启动子和终止子，LacI基因的末端紧接启动子P。操作基因O占据LacZ基因的前26bp，LacZ基因之后是LacY基因和LacA基因以及终止子。乳糖操纵子的控制属负调控：即它被调控蛋白关闭转录。调控因子的失活突变导致功能基因保持表达状态。lacI的表达产物称为乳糖操纵子阻遏蛋白(Repressor)，因为它的功能是阻止结构基因的表达。阻遏蛋白通过与lacZYA基因簇开始处的操纵基因结合发挥功能。操纵基因位于启动子和结构基因(lacZYA)之间。阻遏蛋白和操纵基因结合时，能阻止RNA聚合酶在启动子上的转录.

第32页，共63页，2023年，2月20日，星期二3个结构基因各决定一种酶：

Z编码-半乳糖苷酶；

Y编码-半乳糖苷透过酶；

A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶。第33页，共63页，2023年，2月20日，星期二β-半乳糖苷酶是一种β-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透过酶的作用是使外界的β-半乳糖苷透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。β-半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。第34页，共63页，2023年，2月20日，星期二Z、Y、A基因产物由同一条多顺反子mRNA分子所编码。该mRNA分子的启动区（P）位于阻遏基因（I）与操纵区（O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达。

操纵区是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。当阻遏物与操纵区相结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制。诱导物通过与阻遏物结合，改变其三维构象，使之不能与操纵区相结合，诱发lacmRNA的合成。第35页，共63页，2023年，2月20日，星期二下面就以乳糖操纵子为例子说明操纵子的

最基本的组成元件（elements）结构基因(structuralgene):操纵子中被调控的编码蛋白质的基因。启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。操纵（序列）基因(operator，O)是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列。调控基因(regulatorygene)是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。第36页，共63页，2023年，2月20日，星期二在乳糖操纵子中，这种应答诱导物的成分就是lacI编码的阻遏蛋白。它在应答环境变化时控制结构基因lacZYA转录的作用。阻遏蛋白的状态决定启动子是开启还是关闭：缺乏诱导物时，由于阻遏蛋白具有结合操纵基因的活性。结构基因不被转录。而加入诱导物后，阻遏蛋白变成非活性形式离开操纵基因，因此转录从启动子开始，并通过结构基因，一直转录到位于lacA边上的终止子，转录成一条mRNA。图。阻遏蛋白与操纵子结合，使乳糖操纵子处于失活状态，加入诱导物以后，阻遏蛋白被释放出来，才允许RNA聚合酶起始转录。第37页，共63页，2023年，2月20日，星期二第38页，共63页，2023年，2月20日，星期二阻遏物lacI基因产物及功能lac操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下永久型合成的，该阻遏蛋白有4个相同的亚基，每个亚基均含有347个氨基酸残基，并能与1分子IPTG结合,每个细胞中有5～10个阻遏物分子。第39页，共63页，2023年，2月20日，星期二β-半乳糖苷酶在乳糖代谢中的作用是把前者分解成葡萄糖及半乳糖。如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac操纵子（图6-11）。第40页，共63页，2023年，2月20日，星期二第41页，共63页，2023年，2月20日，星期二CAP的正调控

细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，cAMP通过与cap基因产物结合，使代谢产物调控的操纵子的表达与cAMP水平成正比。cap基因产物称为分解代谢物激活蛋白(Cataboliteactivatorprotein，CAP)。cap基因突变可阻止操纵子的激活，而在葡萄糖缺乏时，这些操纵子能被正常表达。CAP是一正调控因子，在依赖CAP的启动子上起始转录必须有CAP参加。只有cAMP存在时，CAP才有活性.第42页，共63页，2023年，2月20日，星期二某大肠杆菌突变体，它不能将葡萄糖-6-磷酸转化为下一步代谢中间物，该细菌的lac基因能在葡萄糖存在时被诱导合成。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制lacmRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应称之为代谢物阻遏效应（cataboliterepression）。第43页，共63页，2023年，2月20日，星期二

cAMP与代谢物激活蛋白cAMP是在腺苷酸环化酶的作用下由ATP转变而来的，在真核生物的激素调节过程中也起着十分重要的作用。将细菌放在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的浓度就低；如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，cAMP的浓度就会很高。第44页，共63页，2023年，2月20日，星期二大肠杆菌中的代谢物激活蛋白，由Crp基因编码，能与cAMP形成复合物。CRP和cAMP都是合成lacmRNA所必需的，cAMP-CRP是一个不同于阻遏物的正调控因子，而lac操纵子的功能是在这两个相互独立的调控体系作用下实现的。第45页，共63页，2023年，2月20日，星期二图6-13gal，lac和ara操纵子上游启动子区与CRP-cAMP结合位点的相对位置分析第46页，共63页，2023年，2月20日，星期二半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇等在降解过程中均转化成葡萄糖或糖酵解途径中的其他中间产物，这些糖代谢中有关的酶都是由可诱导操纵子控制的，被称为降解物敏感型操纵子(catabolitesensitiveoperon），由cAMP-CRP调控。第47页，共63页，2023年，2月20日，星期二第48页，共63页，2023年，2月20日，星期二cAMP-CRP复合物与启动子区的结合是lacmRNA合成起始所必需的，因为这个复合物结合于启动子上游，能使DNA双螺旋发生弯曲，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。阻遏物则是一个抗解链蛋白，阻止形成开放结构，从而抑制RNA聚合酶的功能。第49页，共63页，2023年，2月20日，星期二第50页，共63页，2023年，2月20日，星期二6.2.3lac操纵子的调控区域—P、O区P区（即启动子区）一般是从I基因结束到mRNA转录起始位点下游5-10bp，而O区（即阻遏物结合区）位于-7～+28位，该区的碱基序列有对称性，其对称轴在+11位碱基对。第51页，共63页，2023年，2月20日，星期二第52页，共63页，2023年，2月20日，星期二3.2.4lac操纵子中的其他问题1、lac基因产物数量上的比较在完全被诱导的细胞中，β-半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶的拷贝数比例为1：0.5：0.2，这个比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作为唯一碳源时细胞的需要。不同的酶在数量上的差异是由于在翻译水平上受到调节所致。第53页，共63页，2023年，2月20日，星期二①lacmRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译。因此，存在着从mRNA的5'末端到3'末端的蛋白质合成梯度。第54页，共63页，2023年，2月20日，星期二②在lacmRNA分子内部，A基因比Z基因更易受内切酶作用发生降解，因此，在任何时候Z基因的完整拷贝数要比A基因多。第55页，共63页，2023年，2月20日，星期二2、操纵子的融合与基因工程pur操纵子在染色体上位于lac操纵子沿转录方向的下游，中间只隔了一个控制细胞对T6噬菌体敏感性的tsx基因。pur操纵子被“嫁接”到lac启动子上，形成融合基因。因为lac启动子是一个很强的启动子，通过它可以使较弱启动子的转录增强。第56页，共63页，2023年，2月20日，星期二6.6