流式细胞仪应用幻灯

流式细胞仪应用幻灯第1页/共53页流式细胞仪发展1953年ParkerHorst描述一种全血细胞计数器，成为流式细胞仪的雏形。1969年VanDilla,Fulwyler及同事们在现在的NationalFlowCytometryResourecLabs,发明第一台荧光检测细胞计。1973年BD推出全球第一台商业化流式细胞仪(FACSI)，确立了在细胞学研究领域的领先地位。1995年生产出当今世界唯一的全自动化四色流式细胞分析分选仪（BDCalibur）。流式细胞仪是伴随着激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术等新科技而出现的高技术含量多应用范围的科学仪器。第2页/共53页BD公司所有流式细胞仪机型CaliburLSRCantoIIAriainflux第3页/共53页不同机型—老师们应关注什么？机器的荧光通道-----确定抗体荧光素的选择是否带有分选使用软件有哪些机器灵敏度如何!!!第4页/共53页第5页/共53页流式细胞仪结构示意图液流系统光路系统电子系统数据系统细胞分选系统第6页/共53页流动室鞘液石英玻璃

样品层流原理：流体在管内流动时，其质点沿着与管轴平行的方向作平滑直线运动。流体聚焦激发光源液流系统细胞如何实现单细胞检测？第7页/共53页光信号如何收集？光学收集器是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，可将产生的不同波长光信号引导至不同的电子探测器。第8页/共53页光学滤片分光器光电探测器信号名称激发波长发射波长FCSSSCFL1FL2FL3FL4FITCPFPerPCAPC侧向前向488488488488488633525575667660488488(FACSCalibur型

)光路系统第9页/共53页激光激发细胞后产生哪些信号？第10页/共53页流式检测对象要求？目标物可以是细胞、细菌或各种微粒0.5um~50um范围内动物标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。以及血清或各类体液样本。第11页/共53页流式图片如何解读？单参数直方图第12页/共53页双参数二维点图第13页/共53页二维等高图和密度图第14页/共53页三维图Pseudo3DPlot3DPlot第15页/共53页坐标类型：线性放大坐标，对数放大坐标第16页/共53页流式得到的数据如何分析？BDCalibur:cellquest软件BDcantoII，Aria,LSR：DIVA软件不同品牌，不同类型流式细胞仪使用的分析软件不同。流式细胞仪同一数据标准为FSC文件（国际流式协会制定）由斯坦福大学设计研发的一款非常强大的流式数据分析软件---------FlowJo软件第17页/共53页FlowJo特点：------针对于不同机型的流式提供一个相同的分析平台------在任何电脑上分析任何流式数据------直接将分析报告输出到幻灯片，或存为PDF文档，EXCEL文件脱离硬件荧光补偿，用软件做采集后荧光补偿轻松的导出高质量的图表用于发表文章采用模版和批量分析工具简化重复性的分析制作数据电影用三维图查看你的数据•中文技术博客/u/flowjo/•视频讲座和网络讲座•免费培训讲座第18页/共53页如何界定阳性阴性？阴性对照组和CD3FITC/CD19PE双染样本散点图象限界定下图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19PE），右下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3FITC），右上象限（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。第19页/共53页直方图阳性界定第20页/共53页流式几个重要概念门：第21页/共53页阈值：用于设置低于该道值的信号不被处理，只有高于等于阀值道数的信号才会被送入计算机进行处理。如：对免疫表型实验，阀值应设为FSC，以消除低于值道数的碎片。用户可根据实验要求设置其它参数的阀值。第22页/共53页同型对照

------除去荧光抗体的特异性决定位点荧光扣除对照（FMO）

第23页/共53页补偿第24页/共53页第25页/共53页第26页/共53页抗体如何选择？原则1:针对您特定的仪器配置，选择最亮的荧光素。原则2:选则荧光素要尽量降低光谱叠加的可能.原则3:保留最亮的荧光素给弱表达的抗体，反之依然。原则4:要避免把高亮度群体的荧光渗漏到需要保持高敏感性的测试通道中去。原则5:尽量避免偶联染料的降解，考虑它是否会影响结果。第27页/共53页抗体染色一般方法外周血白细胞分析：100ul全血血小板分析：1-5ul全血（根据样本血小板数量）红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使用）骨髓：20ul其他样本，计数后决定使用体积目标细胞数量及检测终浓度：1×106/ml第28页/共53页孵育、溶血、固定抗体孵育：室温下避光15分钟（某些情况下如：细胞内因子检测需冰育）溶血：如样本含中有红细胞需溶血（见下页）样本溶血后需立即上机检测，固定后可放置较长时间第29页/共53页人外周血淋巴亚群分群样品来源：外周血实验目的：T细胞，B细胞，NK细胞，辅助性T细胞，毒性及抑制性T细胞在淋巴细胞内的百分比。流式细胞仪型号：BDCalibur例第30页/共53页外周血：红细胞、白细胞、血小板红细胞去除方法：溶血血小板出去方法：离心以及设定阈值淋巴细胞，单核细胞，粒细胞区分方法：前向侧向信号，CD45设门。第31页/共53页人外周血淋巴细胞组成：T淋巴细胞(CD3+)

Th细胞（CD3+CD4+）Tc/Ts细胞（CD3+CD8+）B细胞(CD3-CD19+)NK自然杀伤细胞（CD3-/CD16+CD56+）抗体选择：

CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC

CD3-FITC/CD19-PE/CD45-PreCP/CD15/56-APC第32页/共53页第33页/共53页流式细胞术与凋亡AnnexinV-FITC和PI双染细胞第34页/共53页试管数：四管（阴性对照，AnnexinV-FITC单染染，PI单染管，双染样品检测管）第35页/共53页Br-dUTP（三磷酸溴脱氧尿苷）链接DNA断裂点检测凋亡此法也称为TUNEL法检测凋亡细胞第36页/共53页凋亡相关蛋白检测caspase-3活性试验Ae-DEVD-AMC是一种人工合成的四肽荧光复合物，caspase-3可将其分解为DEVD和AMC两个片段，其中AMC是一种荧光基团，可在380nm紫外线波长激发下发出450nm波长的荧光，因此通过具有紫外线激发光源的流式细胞仪就可以检测到AMC的荧光强度。通过对AMC荧光强度的检测，间接地测定easpase-3的活性并可进行定量分析。p53、bcl-2、Apo-1(Fas)等也可以用FCM进行快速、方便的检测。第37页/共53页流式细胞仪与DNA倍体分析由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。流式细胞仪要求：488nm光源，575nm滤光片（第二通道）第38页/共53页G0/G1期DNA含量为2C,为二倍体细胞S期细胞,DNA含量开始增加,>2CG2/M期细胞,DNA含量开始增加至4C第39页/共53页单个细胞圈定原理VoltageLaserLaserLasertttVoltageVoltage1.2.3.单个细胞第40页/共53页DNA倍体分析结果第41页/共53页DNA倍体分析影响因素及实验要求试剂：A液：含有胰蛋白酶，四氯化精胺去污剂，可用于分离实体组织片段，消化细胞膜以及细胞骨架。

B液：含有胰蛋白酶抑制剂，RNA酶，柠檬酸盐缓冲液，等

C液：PI染料，以及缓冲液。

DNA倍体分析软件：ModiFIT软件影响因素：CV值，碎片，联体细胞。机器设置要求：样品流速低速，坐标轴为线性

第42页/共53页核酸染料第43页/共53页增殖相关蛋白1，Ki67，运用此抗体可区分出处于细胞周期循环中的细胞，用于评估肿瘤细胞的增殖状况。2，PCNA，核增殖抗原是一个多功能蛋白。它参与DNA合成酶的生成，与CDKs,cyclins交互反应，并与CDK抑制蛋白P21形成三聚体，并参与DNA修复。当细胞处于S期时，PCNA与染色质聚合，当细胞经去污剂溶解后其仍存在细胞核内。通过对其染色可区分出GO/G1、S、G2/M期细胞。3，P105蛋白，当细胞拥有高度浓缩染色质时高度表达，如M、G0期细胞。使用此蛋白抗体可区分出M期细胞。第44页/共53页流式细胞仪除了可以进行百分比计算，还可以精确计算某种特异性细胞的绝对浓度原理：流式细胞仪的细胞绝对计数BD绝对计数管（货号340334）第45页/共53页第46页/共53页第47页/共53页流式液相芯片技术“海量”检测可溶性蛋白

---------CBA第48页/共53页第49页/共53页