流式细胞仪分析

流式细胞仪分析第1页/共49页流式细胞仪分析

技术及应用第2页/共49页2023/4/163流式细胞术（FCM）——是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。（图1、2、3）第3页/共49页2023/4/164第一节流式细胞仪的分析及

分选原理流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成。流式细胞术所具有的分析和分选功能主要涉及光学原理、光电转换原理和测试原理三部分。第4页/共49页2023/4/165一、工作原理

㈠基本组成结构1、液流系统：由样本和鞘液组成。样本：待测细胞被制备成单个细胞的悬液后经荧光染料标记的单克隆抗体染色；鞘液：是辅助样本流被正常检测的基质液。作用（图4）第5页/共49页2023/4/1662、光学系统：由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。⑴激光光源：多为气冷式氩离子激光器，其激光束波长为488nm，15mW。⑵分色反光镜：反射较长波长的光，通过较短波长的光。⑶光束成形器：将激光器发射的激光束聚焦成高15μm、宽57μm的椭圆光斑。第6页/共49页2023/4/167⑷透镜组：将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。⑸滤片：长通滤片一允许长于设定波长的光通过；短通滤片一允许短于设定波长的光通过；带通滤片一允许一定带宽波长的光通过，其他波长的光不能通过。⑹光电倍增管：检测荧光和散射光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。（图13）第7页/共49页2023/4/1683、数据处理系统：主要由计算机及其软件组成。第8页/共49页2023/4/169㈡基本工作原理标志了特异性荧光染料的单细胞悬液经喷嘴高速射下，与水平方向的高度聚焦的激光束垂直相交，单个细胞上标记的荧光染料在通过激光光斑时被激发而产生特异性荧光，同时，由于混合细胞群中细胞大小和胞内颗粒的多少会被激发而产生不同的散射光。在入射光束与液柱垂直的方向有荧光检测系统和散射光感受系统，用于收集荧光信号和侧向散射光信号，前向散射光感受器在前向小角探测接受前向光信号。第9页/共49页2023/4/1610被接收的光电信号被光电倍增管转换成电压脉冲和积分脉冲，使信号放大，该信号进入计算机系统进行数据转换、储存、分析、处理，按不同的检测设计采用相应软件程序对结果进行综合分析，并以图像和数据显示于荧光屏上。流式细胞仪产生分析的电信号主要是光散射信号和荧光信号，流式细胞仪依据细胞流经光照射区时电压讯号的强弱来分析和分选细胞。（图5）（图10）第10页/共49页2023/4/1611二、散射光的测定

细胞对光的散射是细胞在未遭受任何破坏情况下固有的特性。第11页/共49页2023/4/1612㈠前向散射光（FS）由激光束前方的FS检测器收集，FS信号的强弱与细胞的体积大小成正比，用于检测细胞或其他粒子物质的表面属性。（图11）

（图6）第12页/共49页2023/4/1613㈡侧向散射光（SS）由激光束垂直方向的侧向检测器收集，SS信号的强弱与细胞或其他颗粒的大小。形状及粒度成正比。SS用于检测细胞内部结构属性，可获得有关细胞内超微结构和颗粒性质的参数。（图12）

（图7）第13页/共49页2023/4/1614三、荧光测量荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生，每种荧光染料都有特定的激发波长，激发后又会产生特定波长荧光和颜色，通过滤光片，将不同波长的散射光，荧光信号区分并送到不同的光电倍增管，经过一系列信号转换、放大、数字化处理，就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞百分率。第14页/共49页2023/4/1615

选择不同的单克隆抗体及荧光染料就可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同特征。流式细胞仪的检测原理中最重要的一点就是检测荧光的特定发射波长。第15页/共49页2023/4/1616㈠光信号测量线性放大器用于测量信号强度变化范围较少或代表生物学线性过程的信号。对数放大器用于测量信号强度变化范围大且光谱信号较复杂的信号。（图13）流式细胞仪中最常用于单抗标记的荧光染料是FITC、PE、ECD或PeCy5。第16页/共49页2023/4/1617㈡荧光补偿（图8）通常用荧光补偿的方法来消除重叠信号，保证检测信号的正确性。第17页/共49页2023/4/1618四、细胞分选原理

㈠基本原理当细胞悬液形成液流柱经流动室，通过机械振动使液流柱断裂成一连串均匀的液滴，当实验设计中设定了被分选细胞的特性参数时，此类细胞在形成液滴时会被充电，使其带有正电荷或负电荷，带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场，依所带电荷是正或是负而发生向右或向左道偏转，落人指定的收集器中，完成细胞分选的目的。（图14）

（图9）第18页/共49页2023/4/1619㈡技术要求1、分选速度：至少5000个/秒，与分选细胞在悬液中的含量有关。2、分选纯度：除与仪器的精密度相关外，还与被分选细胞与其他细胞有无相互重叠相关。第19页/共49页2023/4/16203、分选收获率：指设定通过测量点的分选细胞与实际收获的分选细胞之间的比率。与被分选细胞与其他细胞有无相互重叠相关，还与纯度有关，纯度↑→收获率↓。4、分选得率：是指从一群体细胞悬液中分辨出的目的细胞总量，再经分选后获得的目的细胞实际比率。与分选速度相关，分选速度↑→分选得率↓。第20页/共49页2023/4/1621第二节数据的显示与分析略！第21页/共49页2023/4/1622第三节流式细胞仪免疫

分析的技术要求

一、免疫检测样品制备制备单细胞悬液是最关键的第一步。㈠外周血淋巴细胞样品的制备单个核细胞的分离制备，最常用单次密度梯度离心法第22页/共49页2023/4/1623㈡培养细胞的样品制备㈢新鲜实体组织单细胞悬液的制备常用方法有机械法、酶处理法、化学试剂处理法和表面活性剂处理法。㈣单细胞悬液的保存1、深低温保存法2、乙醇或甲醇保存法3、甲醛或多聚甲醛保存法第23页/共49页2023/4/1624二、免疫分析中常用的

荧光染料与标记染色

㈠常用的荧光染料荧光染料需具备条件：1、有较高的量子产额和消光系数；2、对488nm的激发光波长有较强的吸收；3、发射光波长与激发光波长之间有较大的波长差；4、不影响结合抗体自身的特异性。第24页/共49页2023/4/1625常用荧光染料：1、异硫氰酸荧光素（FITC）：最常用，发亮绿色荧光，但发射荧光强度易受PH值影响。2、罗丹明：发红色荧光，缺点是不易溶于水。3、藻胆蛋白类：发橙色至红色荧光，最常用的是藻红蛋白（PE）。第25页/共49页2023/4/1626㈡免疫荧光标记荧光染料与细胞成分结合的方式：1、结构亲和式：以电力结合，为带正电荷的荧光分子与带负电荷的核酸分子磷酸基团相互吸引2、嵌入结合方式：光分子直接嵌入核酸碱基对中。3、共价键结合方式：细胞DNA键的连接之间以原子结合方式展开，荧光分子与其形成共价结合方式。第26页/共49页2023/4/16274、荧光标记抗体特异性结合方式：荧光分子与单克隆抗体的F（ab）’2片段氨基发生化学反应而形成荧光标记基团。前三种染色方式常用于细胞内成分的染色分析，第四种方式为流式免疫荧光分析所常用。⑴直接免疫荧光染色法⑵间接免疫荧光染色法⑶双参数或多参数分析时荧光抗体的组合技术第27页/共49页2023/4/1628㈢细胞自发荧光大部分哺乳动物细胞内的吡啶或黄素类核苷酸都存在自发荧光，用紫外光或蓝光激发可蓝色或绿色荧光。

在免疫检测中，淋巴细胞的自发荧光强度易引起信号干扰，出现假阳性结果，特别是在用FITC标记染色时。第28页/共49页2023/4/1629三、流式细胞免疫学技术的质量控制

㈠单细胞悬液制备的质量控制1、采用适当的制备方式2、温度与PH第29页/共49页2023/4/1630㈡细胞悬液免疫荧光染色的质量控制1、温度对荧光染色的影响2、PH对荧光发射强度的影响3、荧光染料浓度的控制4、固定剂对免疫荧光染色的影响第30页/共49页2023/4/1631㈢仪器操作技术的质量控制1、光路与流路校正2、PMT校准3、绝对计数的校准第31页/共49页2023/4/1632㈣免疫检测的质量控制1、同型对照：为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组织来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整及设置电流电压，在此基础上进行样本检测可使荧光标记单抗的信号保持特异性，如不用同型对照，结果的可靠性将受到影响。第32页/共49页2023/4/16332、全程质控质控物Immuno-TrolCells是全血质控的冻干品，将其复溶后与待检标本一起标记、洗涤和检测，所得结果如达标定靶值，提示本次实验结果可靠。第33页/共49页2023/4/1634第四节流式细胞术在免疫学

检查中的应用一、淋巴细胞及其亚群的分析二、淋巴细胞功能分析三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型四、肿瘤耐药基因分析五、在AIDS病检测中的分析六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析第34页/共49页2023/4/1635掌握：⑴流式细胞仪的工作原理；⑵流式细胞仪的技术要点熟悉：流式细胞术在免疫学检查中的应用了解：流式细胞仪的数据显示与分析第35页/共49页2023/4/1636图1流式细胞仪第36页/共49页2023/4/1637图2流式细胞仪第37页/共49页2023/4/1638图3流式细胞仪第38页/共49页2023/4/1639图4流式细胞流动池模拟图前向散射光鞘液喷嘴侧向荧光信号第39页/共49页2023/4/1640图5FCM工作原理流程图鞘液分光镜红色荧光绿色荧光90°散射光前向散射光激光器细胞收集管细胞悬液电荷环偏转板废液第40页/共49页2023/4/1641图6前向散射光示意图大颗粒小颗粒激光器激光器激光探测器第41页/共49页2023/4/1642复杂性颗粒简单性颗粒侧向散射光探测器激光器激光器图7侧向散射光示意图第42页/共49页2023/4/1643图84色荧光峰形线图FITCRD1ECDPC5荧光波长（nm）荧光强度第43页/共49页2023/4/1644图9细胞分选原理3、细胞分选2、细胞膜、胞质、胞核着色1、细胞悬液4、细胞培养、研究喷嘴激光第44页/共49页2023/4/1645图10流式细胞仪工作原理喷嘴压电晶体分色反光镜阻断滤片偏转板－＋废液抽吸