基因工程习题与答案

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基因工程原理练习题及其答案

一、填空题

1．基因工程是_____1970’____年代发展起来的遗传学的一个分支学科。

2．基因工程的两个基本特点是：(1)分子水平上的操作；(2)细胞水平上的表达。

3．基因克隆中三个基本要点是：克隆基因的类型；受体的选择；载体的选择。

4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的_限制性酶切图谱。

5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自属名的第一个字母；其次、三两个字母取自种名的前两个字母；第四个字母则用株名表示。

6．部分酶切可采取的措施有：(1)减少酶量；(2)缩短反应时间；(3)增大反应体积等。

7．第一个分开的限制性内切核酸酶是EcoK；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是EcoRl。

8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是GGCC，它们属于异源同工酶。

9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用枯草杆菌蛋白酶切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)5'-3'合成酶的活性；(2)3'-5'外切核酸酶的活性。

10．为了防止DNA的自身环化，可用_碱性磷酸酶__去双链DNA_5’端的磷酸基团_。

11．EGTA是_Ca2+_离子螯合剂。

12．测序酶是修饰了的T7DNA聚合酶，它只有5'-3'合成酶的活性，而没有3'-5'外切酶的活性。

13．切口移位(nicktranslation)法标记DNA的基本原理在于利用DNA聚合酶I的5'一3'合成酶和5'一3'合成酶的作用。

14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，寻常可采用S1核酸酶切割或DNA聚合酶补平。

15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有核酸水解酶H的作用，可以将DNA-

RNA杂种双链中的RNA水解掉。

16．基因工程中有3种主要类型的载体：质粒DNA、病毒DNA；质粒和病毒DNA杂合体。

17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：复制区：含有复制起点；选择标记：主要是抗性基因；克隆位点：便于外源DNA的插入。另外，一个理想的质粒载体必需具有低分子量。

18．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测

不出质粒，这种现象叫质粒消除(或治愈)。

19．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于pMBl，它的四环素抗性基因来自于

pSCl01，它的氨苄青霉素抗性基因来自于pSF2124(R质粒)。

20．YAC的最大容载能力是1000kb，BAC载体的最大容载能力是300kb。

21．pSCl01是一种严紧复制的质粒。

22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过pBR322和M13两种质粒改造而来。它的复制子来自pMBl，Amp抗性基因则是来自转座子。

23．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是它在细菌中能够大量繁殖，

这样有利于外源DNA的扩增；二是对某些噬菌体(如噬菌)的遗传结构和功能研究得比较明白，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究得比较详尽。

24．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是没有适合的限制性内切核酸酶识别位点和选择标记。

25．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自质粒、COS位点序列来自噬

菌体，最大的克隆片段达到45kb。

26．野生型的噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1)分子量大，(2)酶的多切点，

(3)无选择标记。

27．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是复制区，而来自噬菌体的主要结构是IG区。

28．噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基因组的75％～105％的范围内。

29．在分开DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是螯合Mg2+离子，抑制核酸酶的活性。

30．用乙醇沉淀DNA时，寻常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc，其目的是中和DNA分子的负电荷，增加DNA分子间的凝聚力。

31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1)合成探针；(2)合成cDNA；(3)用于PCR反应；(4)进行序列分析。

32．Clark发现用TaqDNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出

碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的T—载体

33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在其次链合成时形成的发夹环。

34．乙醇沉淀DNA的原理是乙醇使DNA分子脱水。

35．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必需考虑其表达的三个基本条件：

(1)保持正确的可读框(2)能够使其转录的启动子(3)具有翻译的起始和终止信号

36．受体细胞的感受态是接受外源DNA的生理状态_。

37．DNA重组连接的方法大致分为四种：(1)黏性末端连接；(2)平末端连接；(3)同聚物接尾连接；(4)接头连接法。

38．将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个基因组DNA克隆，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个基因组DNA文库。

39．将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个cDNA克隆，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个cDNA文库。

40．只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用聚合酶链式反应(PCR)可以将这段DNA

进行百万倍的扩增。

41．人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为0C时吸附DNA,42C时摄人DNA。

42．目前，在重组体的筛选中，已经发展了大量构思巧妙、具有极高确凿性的筛选方法。

大致可以分为：(1)遗传学方法；(2)物理筛选法；(3)核酸杂交法；(4)表达产物分析法等。

43．PCR扩增筛选重组体是比较简便的筛选方法，它适合于插入外源片段的种类较多，大小又极为相像的重组体的筛选。

44．核酸杂交探针可分为两大类：DNA探针和RNA探针。其中DNA探针又分为基因组DNA探针和cDNA探针。

45．假使用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生5’突出的黏性末端，则可以用Klenow酶填补

的方法进行3’末端标记。假使用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3’突出的黏性末端，可以用T4DNA聚合酶进行3’末端标记。

46．单链DNA探针的标记可以采用以下方法：(1)用M13噬菌体载体合成单链DNA探针；(2)从mRNA反转录合成单链cDNA探针；(3)用不对称PCR合成单链DNA探针。

47．根据Northern杂交的结果可以说明：外源基因是否进行了转录。

48．差示杂交(differentialhybridization)技术需要两种不同的细胞群体能够表达不同的基因，即在一个群体中能够表达一些基因，而在另一个细胞群体中不能表达这些基因。

49．RNA分子经凝胶电泳后按大小不同分开，然后被转移到一张硝酸纤维素膜(尼龙膜)上，同一放射DNA探针杂交的技术称Northern印迹。

50．在Southern印迹技术中，DNA限制性片段经凝胶电泳分开后，被转移到硝酸纤维素膜(或

尼龙膜)上，然后与放射性的DNA探针杂交。

51．可用T4DNA聚合酶进行平末端的DNA标记，由于这种酶具有5’3’合成酶和3’5’外切

核酸酶的活性。

52．根据外源片段提供的遗传表型筛选重组体，必需考虑三种因素：(1)克隆的是完整的基因；

(2)使用的是表达载体；(3)不含内含子。

53．Northern印迹和Southern印迹有两点根本的区别：

(1)印迹的对象不同：Northern是RNA，Southern是DNA；(2)电泳条件不同，前者是变性条件，后者是非变性条件。

54．放射免疫筛选的原理基于以下三点：(1)抗体能够被吸附到固体支持物上；(2)同一个抗原可以同几种抗体结合；(3)抗体能够被标记。

二、选择题(单项选择或多项选择)

1．因研究重组DNA技术而获得诺贝尔奖的科学家是(c)

(a)A．Kornberg(b)W．Gilbert(c)P．Berg(d)B．McClintock

2．第一个作为重组DNA载体的质粒是(c)

(a)pBR322(b)ColEl(c)pSCl01(d)pUCl8

3．关于宿主控制的限制修饰现象的本质，以下描述中只有(b)不太恰当。

(a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成

(b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶

(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰

(d)不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统

4．Ⅱ型限制性内切核酸酶：(b)

(a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列

(b)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供

(c)限制性识别非甲基化的核苷酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性

(e)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供

5．下面有关限制酶的表达哪些是不正确的?(a)

(a)限制酶是外切酶而不是内切酶

(b)限制酶在特异序列(识别位点)对DNA进行切割

(c)同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是一致的

(d)一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA，产生黏末端

(e)一些限制酶在识别位点内一致的位置切割双链DNA，产生平末端

6．第一个被分开的Ⅱ类酶是：(c)

(a)EcoK(b)HindⅢ(c)HindⅡ(d)EcoB

7．在以下进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好?(b)

(a)反应时间(b)酶量(c)反应体积(d)酶反应的温度

8．在以下试剂中，那一种可以螯合Ca2+离子?(d)

(a)EDTA(b)柠檬酸钠(c)SDS(d)EGTA

9．在以下工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?(d)

(a)S1单链核酸酶(b)末端转移酶(c)碱性磷酸酶(d)Bal31核酸酶

10．限制性内切核酸酶可以特异性地识别：(b)

(a)双链DNA的特定碱基对(b)双链DNA的特定碱基序列

(c)特定的三联密码(d)以上都正确

11．以下关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是(d)。

(a)Sau3AI(b)E．coRI(c)hindIII(d)Sau3A1

12．限制性内切核酸酶的星号活性是指：(a)

(a)在十分规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。(b)活性大大提高

(c)切割速度大大加快(d)识别序列与原来的完全不同

13．下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?(d)

(a)甘油含量过高(b)反应体系中含有有机溶剂

(c)含有非Mg2+的二价阳离子(d)酶切反应时酶浓度过低

14．关于宿主控制的限制修饰现象的本质，以下描述中只有(b)不太恰当

(a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成

(b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶

(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰

(d)不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统

15．在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用(d)

(a)T4DNA聚合酶(b)Klenow酶．

(c)大肠杆菌DNA聚合酶I(d)T7DNA聚合酶

16．末端转移酶是合成酶类，(c)

(a)作用时不需要模板

(b)在Ca2+的存在下，可以在突出的3，末端延长DNA链

(c)在Ca2+的存在下，可以在隐蔽的3，末端延长DNA链

(d)上述说法有两种是正确的

17．在基因工程中，可用碱性磷酸酶(ab)

(a)防止DNA的自身环化(b)同多核苷酸激酶一起进行DNA的5，末端标记

(c)制备突出的3，末端(d)上述说法都正确

18．以下酶中，除(a)外都具有磷酸酶的活性

(a)λ核酸外切酶(b)外切酶Ⅲ(c)单核苷酸激酶(d)碱性磷酸酶

19．以下哪一种酶作用时需要引物?(c)

(a)限制酶(b)末端转移酶(c)反转录酶(d)DNA连接酶

20．S1核酸酶的功能是(d)

(a)切割双链的DNA(b)切割单链的RNA(c)切割发夹环(d)以上有两项是正确的

21．Klenow酶与DNA聚合酶相比，前者丧失了(c)的活性。

(a)5，--3，合成酶，(b)3，--5，外切酶(c)5，3，外切酶(d)转移酶

22．下面关于松弛型质粒(relaxedplasmid)性质的描述中，(c)是不正确的

(a)质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约，

因而有较多的拷贝数

(b)可以在氯霉素作用下进行扩增(c)寻常带有抗药性标记

(d)同严紧型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子

23．基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的自然质粒载体很少，在以下载体中只有(b)被视为用作基因工程载体的自然质粒载体

(a)pBR322(b)pSCl01(c)pUBll0(d)pUCl8

24．以下哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大?(c)

(a)质粒(b)黏粒(c)酵母人工染色体(YAC)(d)噬菌体(e)cDNA表达载体

25.松弛型质粒：(d)

(a)在寄主细胞中拷贝数较多(b)可用氯霉素扩增

(c)一般没有选择标记(d)上述(a)、(b)两项正确

26．ColEl是惟一用作基因工程载体的自然质粒，这种质粒：(acd)

(a)是松弛复制型（b)具有，四环素抗性

(c)能被氯霉素扩增(d)能产生肠杆菌素

27．同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：(b)

(a)OCDNASCDNALDNA(b)SCDNALDNAOCDNA

(c)LDNAOCDNASCDNA(d)SCDNAOCDNALDNA

28．pBR322是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因，其中四环素抗性基因来自：(c)(a)ColEl(b)Ri质粒(c)pSCl01(d)pUCl8

29．关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法最正确?(b)

(a)在不同的宿主中具有不同的复制机制

(b)在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点

(c)在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶

(d)在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率

30．能够用来克隆32kb以下大小的外源片段的质粒载体是(a)

(a)charomid(b)plasmid(C)cosmid(d)phagemid

31．第一个作为重组DNA载体的质粒是(c)

(a)pBR322(b)ColEl(c)pSCl01(d)pUCl8

32.Ti质粒：(acde)

(a)可从农杆菌转到植物细胞中(b)作为双链DNA被转移

(c)在植物中导致肿瘤(d)介导冠瘿碱的合成，作为细菌的营养物和植物的生长激素(e)需要细菌的vir基因帮助转移(f)在植物细胞中作为染色体外质粒

33．黏粒(cosmid)是一种人工建造的载体，(abc)

(a)它具有COS位点，因而可进行体外包装(b)它具有质粒DNA的复制特性

(c)进入受体细胞后，可引起裂解反应(d)进入受体细胞后，可引起溶源化反应

34．有两种确定核酸中核苷酸序列的方法：化学序列分析法(Maxam-Glbert)和酶学序列分析法

(Sanger)。酶学测序法的基本原理／优点是：(b)

(a)碱基与特别染料间不同的相互作用

(b)一个合成引物的延伸和DNA修复合成的可靠终止

(c)限制性位点与DNA末端标记的相关性

(d)可同时对DNA双螺旋的两条链进行测序

(e)反应是DNA特异的，RNA不会带来干扰。这样既减少纯化步骤，也俭约了开支。

35．关于cDNA的最正确的说法是：(c)

(a)同mRNA互补的单链DNA(b)同mRNA互补的双链DNA

(c)以mRNA为模板合成的双链DNA(d)以上都正确

36．用碱法分开质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是由于：(c)

(a)染色体DNA断成了碎片(b)染色体DNA分子量大，而不能释放

(c)染色体变性后来不及复性(d)染色体未同蛋白质分开而沉淀

37.关于碱解法分开质粒DNA，下面哪一种说法不正确?(d)

(a)溶液I的作用是悬浮菌体(b)溶液Ⅱ的作用是使DNA变性

(c)溶液Ⅲ的作用是使DNA复性

(d)质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性

38.Clark做了一个好玩儿的试验，发现TaqDNA聚合酶可以不需要模板，在双链DNA的

末端加一个碱基，主要是加(b)．

(a)dGTP(b)dATP(c)dCTP(d)dTTP

39．根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。在以下文库中，(c)属cDNA文库

(a)YAC文库(b)MAC文库(c)扣减文库(d)BAC文库

40．下面关于多克隆位点(multipleclonesite,MCS)的描述，不正确的—句是(a)

(a)仅位于质粒载体中(b)具有多种酶的识别序列

(c)不同酶的识别序列可以有重叠(d)一般是人工合成后添加到载体中

41．在cDNA技术中，所形成的发夹环可用(c)

(a)限制性内切核酸酶切除(b)用3外切核酸酶切除

(c)用S1核酸酶切除(d)用5外切核酸酶切除

42．在DNA的酶切反应系统中，寻常：(abc)

(a)用SSC缓冲液(b)参与Mg2+作辅助因子

(c)参与BSA等保护剂(d)上述说法中，有两项是正确的

43．黏性末端连接法，不仅操作便利，而且(b)

(a)产生新切点(b)易于回收外源片段(c)载体不易环化(d)影响外源基因的表达

44．在以下表型中，(b)是基因工程上理想的受体菌表型

(a)r+m+rec*(b)r-m-rec-(C)r-m-rec+(d)r+m+rec-

45．关于DNA接头在基因工程中的作用，以下说法中哪一项不正确?(d)

(a)给外源DNA添加适当的切点(b)人工构建载体

(c)调整外源基因的可读框(d)增加调控元件

46．cDNA文库包括该种生物的(a)

(a)某些蛋白质的结构基因(b)所有蛋白质的结构基因

(c)所有结构基因(d)内含子和调控区

47．以下关于建立cDNA文库的表达中，哪一项为哪一项错误的?(a)

(a)从特定组织或细胞中提取DNA或RNA

(b)用反转录酶合成mRNA的对应单链DNA

(c)以新合成的单链DNA为模板合成双链DNA

(d)新合成的双链DNA甲基化

48．以下对黏性末端连接法的评价中，哪一项为哪一项不正确的?(c)

(a)操作便利(b)易于回收片段

(c)易于定向重组(d)载体易于自身环化，降低重组率

49．关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确?(c)

(功具有可诱导性(b)具有可转移性

(c)细菌生长的任何时期都可以出现(d)不同细菌出现感受态的比例是不同的

50．下面关于用T4多核苷酸激酶标记5'端制备探针的描述中(b)是不正确的。

(a)既能标记DNA，又能标记RNA(b)既能标记双链DNA又能标记单链DNA

(c)只能标记突出的5'端不能标记其他类型末端

(d)DNA或RNA必需有5'-OH的存在

51．Southem印迹的DNA探针(c)杂交。

(a)只与完全一致的片段(b)可与任何含有一致序列的DNA片段

(c)可与任何含有互补序列的DNA片段’．

(d)可与用某些限制性内切核酸酶切成的DNA片段(e)以上都是

52．用以下方法进行重组体的筛选，只有(c)说明外源基因进行了表达。

(a)Southem印迹杂交(b)Northem印迹杂交

(c)Western印迹(d)原位菌落杂交

53．以下哪一个不是Southern印迹法的步骤?(b)

(a)用限制酶消化DNA(a)DNA与载体的连接

(c)用凝胶电泳分开DNA片段(d)DNA片段转移至硝酸纤维素膜上

(e)用一个标记的探针与膜杂交

54．报告基因(acd)

(a)以其易于分析的编码序列代替感兴趣基因的编码序列

(b)以其易于分析的启动子区代替感兴趣基因的启动子区

(c)能用于检测启动子的活性(d)能用于确定启动子何时何处有活性

55．在利用lacZ失活的显色反应筛选法中，IPTG的作用是(a)

(a)诱导宿主的α肽的合成(b)诱导宿主的ω肽的合成

(c)作为酶的作用底物(d)作为显色反应的指示剂

56.切口移位是指在(b)作用下，使()带上放射性标记。

(a)DNA聚合酶I，RNA(b)DNA聚合酶I，DNA

(c)DNA聚合酶Ⅲ，RNA(d)DNA聚合酶Ⅲ，DNA

57．用于核酸分子杂交的探针可以是放射性标记的(ab)

(a)DNA(b)RNA(c)抗体(d)抗原

58．Southern印迹是用DNA探针检测DNA片段，而Northern印迹则是：(c)

(a)用RNA探针检测DNA片段(b)用RNA探针检测RNA片段

(c)用DNA探针检测RNA片段(d)用DNA探针检测蛋白质片段

59．用免疫化学法筛选重组体的原理是(a)

(a)根据外源基因的表达(b)根据载体基因的表达

(c)根据mRNA同DNA的杂交(d)根据DNA同DNA的杂交

60．随机引物标记探针，以下各项中哪一项为哪一项不正确的?(d)

(a)双链DNA、单链DNA、RNA都是可以标记的(b)不需要用DnaseI预处理

(c)反应时可用Klenow酶(d)反应时可用DNA聚合酶1

61．在切口移位标记DNA探针时只能使用(b)

(a)Klenow酶(b)DNA聚合酶I(c)DNA聚合酶Ⅱ(d)DNA聚合酶Ⅲ

62．要对一双链的DNA分子进行3末端标记，可用(c)

(a)Klenow酶(b)DNA聚合酶I(c)T4DNA聚合酶(d)T7DNA聚合酶

三、简答题

1．说明SangerDNA测序法的原理。

答：SangerDNA测序法是建立在两个基本原理之上：(1)核酸是依靠于模板在聚合酶的作用下由5'端向3'端聚合(DNA聚合酶参与了细菌修复DNA合成过程)；(2)可延伸的引物必需能提供游离的3'羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3'羟基末端，因此会终止聚合反应的进行。如

果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得4组长度不同的DNA片段。通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的序列。

2．某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因?

答：盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。

3．在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么?

答：回文序列是：5'-CATATG-3，

4．下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列：

GAATCG，AAATTT，GATATC，ACGGCA?为什么?

答：GATATC；AAATTT，由于它们是回文序列。

5．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?

为什么?

答：注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加其次种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。

6．为什么反转录酶在聚合反应中会出错?

答：由于反转录酶缺少在E．coliDNA聚合酶中起校正作用的3'-5'外切核酸酶活性，所以聚合反应往往会出错，在高浓度的dNTP和Mg2+下，每500个碱基中可能有一个错配。

7．什么是测序酶(sequenaseTM)?

答：所谓测序酶即是修饰了的T7DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使T7DNA聚合酶完全失去了3'-5'的外切核酸酶活性，只有5'3'聚合酶的活性，而且聚合能力提高了3～9倍，测序时常用此酶。

8．什么是S1核酸酶作图(S1nucleasemapping)?

S1核酸酶作图是一种对RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法。

9YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性?

YAC带有自然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整

的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。

10．列举质粒载体必需具备的4个基本特性。

(1)独立复制；(2)有选择标记；(3)有独特的酶切位点；(4)能转化但不扩散。

11．什么叫穿梭载体？

含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很简单从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。

12．如何将野生型的噬菌体改造成为一个理想的载体?

(1)削减分子量(除去非必需区和整合区)；(2)削减酶切位点；(3)添加选择标记；

(4)引入终止突变

13．PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必需预先得到什么样的信息?

(1)DNA半保存复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。

(2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。

14．cDNA克隆与基因组克隆有何不同?

基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子。

15．怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRI限制位点中去?

化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，假使用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。

16．简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。

(1)COS位点可以自身环化；(2)可以利用COS位点包装噬菌体颗粒；

(3)可以感染寄主细胞；(4)利用质粒复制子复制，不整合、不裂解。

17．酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在，必需有哪些基本的结构?

(1)着丝粒；(2)端粒；(3)ARS序列。

18．何谓YAC?主要特性是什么?

(1)含有来自其他生物DNA的酵母人工染色体，叫YAC；

(2)主要特性是可以克隆较大的外源片段。

19．Muller的PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的区别在哪里?PCR用双引物，体内复制用单引物。

20．欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如E．coli)中进行表达，克隆时应

注意哪些问题?

应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌。

21．假定你分开到一个E．coli的Thy-突变体，并推测有可能是ThyA基因突变。请设计一个方案用PCR从染色体DNA扩增突变的ThyA基因，测定突变的序列。(注：E．coli

野生型的ThyA基因的序列是已知的)

为了扩增突变体的thyA基因，先设计一对引物，其中一个引物的序列与thyA基因的5’端一致，另一个引物同该基因的3’端互补。在引物的5’端加上适合Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，以便于后来的克隆。将染色体DNA同引物混合后，进行PCR扩增。然后进行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片段，可以直接测序或克隆到适合的载体再测序。

22.你在做Southern印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案，下面一步骤是用NaOH溶液浸泡凝胶，使DNA变性为单链。为了节省时间，你略过了这一步，直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最终发现放射自显影片是空白。错在哪里?假使你的杂交探针是双链的，可能由于在加人杂交混合物之前忘掉将探针变性而得到空白的放射自显影结果。

23．切口移位(nicktranslation)标记探针的主要步骤有哪些?

(1)DNaseI造成切口；

(2)DNA聚合酶III的5’3’外切核酸酶进行切割；

(3)DNA聚合酶Ⅲ的5’3’合成酶进行修补；

(4)在修补过程中，随着切口(nick)的移动，将放射性的底物掺人到双链DNA中。

24．用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA，并进行克隆，在前者的克隆

中筛选到A基因，但在后者的克隆中未筛选到A基因，请说明原因。

原因是：HindⅢ的切点在A基因内。

25．什么是Western印迹?它与Southern印迹有什么不同?

Western印迹是将蛋白质经电泳分开后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。

26．用一限制性内切核酸酶切割Lac+Tet+的质粒载体，已知该酶识别的是4个碱基序列，并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac基因内有切割位点，并在其次个氨基

酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用DNA聚

合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac-Tets

受体菌，筛选Tetr转化子，问：Lac的基因型是什么?并说明原因。

基因型是lac-．原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以Lac的基因是缺陷的。

27．在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么寻常要用cDNA而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子?

这是由于细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。

四、问答题：

1．说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。

限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的各一个首字母，再加上序号。

基本原则：3-4个字母组成，方式是：属名+种名+株名+序号；首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写；其次字母：取种名的第一个字母，斜体小写；

第三字母：(1)取种名的其次个字母，斜体小写；

(2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。

第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的状况而定，

但用正体。顺序号：若在同一菌株中分开了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、Ⅱ、

Ⅲ、…等，用正体。

2．什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影向?

Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限

制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松

动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性寻常称其次活性，而将这种因

条件的改变会出现其次活性的酶的右上角加一个星号表示，因此其次活性又称为星

活性。

概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(5％,v／v)；(2)限制性

内切核酸酶用量过高(100U／ugDNA)；(3)低离子强度(25mmol／L)；(4)高pH(8．0以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如

Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。

3．影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些?

影响DNA连接酶催化连接反应的因素有好多，但温度对连接反应的影响较大。黏性末端链寻常

以12C一15C最好，这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会降低连接酶的活性。平末端连接以室温为宜，由于平末端连接不存在DNA的退火问题，但是温度高于30℃，连接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高10-100倍。DNA中有残存的tRNA不会抑制DNA连接酶的活性，但是，假使NaCl的浓度高于150mmol／L，则对连接反应有强的抑制作用。

另外反应体系中有NH4+离子的存在，对E．coliDNA连接酶具有激活作用。E．coliDNA连接酶需要NAD+作辅助因子，而T4DNA连接酶需要ATP。

4．什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?

Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片

段的分子量为75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。

Klenow酶主要有以下用途：

(1)修复反应，制备平末端

可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或3'突出末端，制备平末端，这样

可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中参与放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针。

用Klenow酶修复5'突出末端的反应主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填补反应；

而修复3'突出末端则是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow酶的切割反应来修复3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。

(2)标记DNA3'突出末端(protrudingend)

该反应分两步进行：先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端，产生3'隐含末端，然后在

高浓度的标记底物(-32p-dNTP)存在下，使降解(3'-5')作用与聚合(5'-3')作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应(exchange／replacementreaction)。不过这一反应用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3'-5'外切核酸酶活性较强。

(3)其他的一些用途：包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA其次链的合成、

在定点突变中用于合成其次链、用引物延伸法(primerextension)制备单链DNA