土壤微生物数量测定

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（一）培养基的制备：

Ⅰ测定微生物总量培养基：

1.细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）牛肉膏Beefextract5.0g蛋白胨Peptone10.0gNaCI5.0g蒸馏水H201000m1

PH7.2~7.4

2.放线菌培养基（高氏1号琼脂培养基）可溶性淀粉20gKNO31gK2HPO40.5gMgSO4?7H2O0.5gNaCl0.05gFeSO4?7H2O0.01gpH7.2-7.4

注：配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调pH。

另：倒平板之前，在溶化的培养基中加重铬酸钾溶液，每300mL培养基加3%重铬酸钾1mL(l00ppm)。

3.真菌培养基（马丁（Martin）-孟加拉红琼脂培养基）葡萄糖10.0gMgSO4.7H2OO.5g蛋白胨5.0g

孟加拉红33.4mg（或者每升加1%溶液3.3mL）K2HPO41g蒸馏水H201000m1PH自然(4~5)

注：⑴灭菌前加卡那霉素20μg/ml，或者倒平板之前加链霉素。⑵倒平板之前加乳酸，每100mL培养基加0.lmL。

以上培养基皆加琼脂15g/L。

Ⅱ测定功能菌所用培养基：

1.亚硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基A）(NH4)2SO42.0gNaH2PO40.25gMnSO4·4H2O0.01gMgSO4·7H2O0.03gK2HPO40.75gCaCO35.0g蒸馏水1000mlPH7.2

注：CaCO3最终加，不需要溶解，直接调PH，培养基中有这个成分是为了缓冲pH。由于硝化细菌的生长会产生酸化效应，使得氢离子过剩，到了一定程度硝化作用将无法继续，所以要碱性物质平衡酸碱。下同。

2.硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基B）NaH2PO40.25gK2HPO40.75gMgSO4·7H2O0.03gMnSO4·4H2O0.01gCaCO31.0gNa2CO31.0gNaNO21.0g蒸馏水1000mlPH7.23.反硝化细菌培养基

柠檬酸钠5.0gKNO32.0gKH2PO41.0g,K2HPO41.0gMgSO4·7H2O0.2g蒸馏水1000mlpH值7.2~7.5

4.好气性自生固氮菌培养基（改良阿须贝(Ashby)无氮培养基）苯甲酸钠1.5gK2HPO40.2gMgSO4·7H2O0.2gNaCl0.2gCaSO4·2H2O0.1gPH7.4—7.6

注：在培养基分装入试管时，每管参与一1cm滤纸长条，要露出液面。

5.氨氧化细菌培养基（蛋白胨氨化培养基）K2HPO40.5gKH2PO40.5g,MgSO4·7H2O0.5g蛋白胨5.0g蒸馏水1000ml

PH7.0~7.2

6.好气性纤维素分解菌培养基（依姆歇涅茨基纤维素分解菌培养基）KH2PO41.0gFeCl3·6H2O0.1gMgSO4·7H2O0.3gCaCl2·6H2O0.1gNaCl0.1gNaNO32.5g

pH7.2～7．4

注：在培养基分装入试管时，每管参与一1cm滤纸长条，需露出液面。

(二)试剂的配制

1.格里斯试剂（GriessReagent）第一、其次液：

第一液：将0.5g的对氨基苯磺酸（SulfanilicAcid）溶于150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。

其次液：将0.5gα-萘胺（α-naphthylamine）参与50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓参与150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。2.纳氏试剂

甲液：将20.0g碘化汞和10.0g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。乙液：将20.0g氢氧化钾溶于100ml水中。

分别配制甲、乙二液，待冷却后混合，放置2天后使用。保存于棕色瓶中。取上清液使用，保存期三周，随着沉淀增加会影响测定结果。3.二苯胺试剂：

溶1.0g无色的二苯胺（Diphenylamine）于20ml蒸馏水中，然后徐徐参与100ml浓硫酸（相对密度1.84）中，保存于棕色瓶中。（三）试验器材：

1.仪器设备

4℃冰箱、立式自动电热压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电子天平、电热恒温水浴锅、超净工作台、微量移液器、全温空气摇床、旋涡混合器、磁力搅拌器、微波炉等。2.器材准备

⑴将90ml水装入250ml三角瓶中，并装有15-20个玻璃珠，灭菌。⑵将9ml水装入试管，灭菌。

⑶试管架，1ml无菌吸管，记号笔，白瓷比色板，接种环，酒精灯等。

（四）试验方法：

1.样品采集

在靠近植株根系部,去除表层0-5cm的表土，采集5~20cm土壤剖面,多点采集,混匀后四分法取1kg,装无菌塑料袋带回，4℃冰箱保存。

2.悬液制备

称取10g土壤样品，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上室温振荡20min，使土样与水充分混合，将土壤中的微生物细胞充分分散，从土壤中分开出来。此为10土壤悬液，吸取lml此土壤悬液于9ml无菌水中，另用无菌吸管吹吸3次混匀，制成10-2土壤悬液。以此类推依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀释度的土壤悬液。3.土壤悬液稀释度选择⑴细菌:10-4~10-6⑵放线菌：10-3~10-5⑶真菌：10-2~10-4

以上采用稀释平板法，分别设置三个浓度梯度，二次重复。⑷亚硝酸细菌：10-3~10-6

-3-6

⑸硝酸细菌：10~10⑹反硝化细菌：10-4~10-7⑺好气性自生固氮菌：10-3~10-6⑻氨氧化细菌：10~10

⑼好气性纤维素分解菌：10-2~10-5以上采用最大或然法（MPN），分别设置四个浓度梯度，三次重复。

-5

-8

-1

4.接种

⑴液体培养基

将六种功能菌培养基分装于试管中，每管5ml，每个菌需培养基12支试管。依照纵3横4的方阵排列于试管架上，标签示之。

用1ml无菌吸管依次从低浓度到高浓度吸取土壤稀释液，放入各自对应编号的管中。另取一管培养基接种1ml无菌水作为对照。⑵琼脂培养基

将细菌、放线菌、真菌琼脂培养基采用混菌法进行接种，每个培养皿接种lml土壤稀释液，二次重复。接种后，倒入15-20ml培养基迅速混匀。

5.培养

将所有试管和平板置于25-28℃黑暗条件下避光培养。培养时间由短到长分别为：⑴真菌：2～3d；⑵细菌：3～4d；⑶放线菌：5～7d。

⑷氨氧化细菌：7～8d；

⑸好气性自生固氮菌：7～8d；⑹亚硝酸细菌：10～14d；⑺硝酸细菌：10～14d；⑻反硝化细菌：10～14d；

⑼好气性纤维素分解菌：10～14d；

6.结果观测

⑴亚硝酸细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，参与格里斯试剂（GriessReagent）第一、其次液各两滴，如有亚硝酸盐存在，则呈红色。

⑵硝酸细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，参与格里斯试剂（GriessReagent）第一、其次液各两滴，如不呈红色，表示亚硝酸均已经完全消失。此时，另取培养液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺试剂2滴，如呈蓝色，则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸，说