第五节食品中维生素类的分析

第五节食品中维生素类的分析第1页，共37页，2023年，2月20日，星期一一、水溶性维生素类的测定

（一）理化性质

水溶性维生素都易溶于水，不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在加热情况下，可大部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响，如维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。

所以测定水溶性维生素一般都在酸性溶液中进行前处理。第2页，共37页，2023年，2月20日，星期一

（二）维生素B族的测定

维生素B1、B2通常采用稀盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶酶解，使结合态维生素游离出来，再进行提取。为了去除杂质，可用活性人造浮石、硅镁吸附剂等进行纯化处理。

第3页，共37页，2023年，2月20日，星期一1、维生素B1的测定

（1）硫色素荧光法：国标法。

①原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中能被氧化成一种强蓝色荧光物质—噻嘧色素（硫色素）。硫色素在紫外线照射下，发出荧光，其强度与硫色素浓度成正比，也即与溶液中硫胺素含量成正比。

激发波长365nm；发射波长435nm。

②样品提取：对于一般样品、高蛋白样品、淀粉质样品处理方法不同，如样品中所含杂质较多，可用柱层析法处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。第4页，共37页，2023年，2月20日，星期一

操作过程：

试样匀浆或粉碎，称样于三角瓶中——加稀盐酸，放入高压锅中加热水解——加淀粉酶、蛋白酶酶解，过滤得提取液——将提取液加入已准备好的盐基交换柱中，过柱——热蒸馏水冲洗交换柱，去杂质——热酸性氯化钾过柱，收集滤液，即为试样净化液——净化液分别加入A、B两个反应瓶——避光，A瓶中加入氢氧化钠溶液，B瓶中加入碱性铁氰化钾溶液，振摇15s——加10mL正丁醇，同时振摇1.5min，静置分层——吸去下层碱性溶液，加无水硫酸钠使溶液脱水——上机测定。第5页，共37页，2023年，2月20日，星期一第6页，共37页，2023年，2月20日，星期一第7页，共37页，2023年，2月20日，星期一

（2）高效液相色谱法

待测样品色谱方式检测器

肉及肉制品正相液相色谱荧光检测器

米粉反相键合相色谱柱后衍生化后

荧光检测器

食品离子交换色谱紫外检测器

米及米制品反相离子对色谱紫外检测器第8页，共37页，2023年，2月20日，星期一GB\GBT5009.84-2003食品中硫胺素(维生素B1)的测定.pdf第9页，共37页，2023年，2月20日，星期一

2、维生素B2的测定

国标第一法为荧光法，第二法为微生物法。

（1）荧光分光光度法

原理：样品经酸解、酶解处理使核黄素游离出来，用高锰酸钾和过氧化氢氧化杂质，再经硅镁吸附剂进行柱层析，吸附提取核黄素，最后用洗脱液——丙酮＋冰乙酸＋水洗脱并收集核黄素。VB2水溶液呈黄绿色荧光，在440nm的激发波长，525nm发射波长处可产生最大荧光强度。

测定谷物中VB2时最好在样品酸解后，加入一定量的淀粉酶，在35～40℃酶解15小时左右，这样有利于结合型的VB2转化成游离型的VB2

。第10页，共37页，2023年，2月20日，星期一

（2）高效液相色谱法

待测样品色谱方式检测器

食品反相键合相色谱荧光检测器

肉及肉制品正相液相色谱荧光检测器

蛋及奶制品反相键合相色谱紫外检测器

米及米制品反相离子对色谱紫外检测器第11页，共37页，2023年，2月20日，星期一

3、维生素B5的测定

国标方法为微生物法。

（1）溴化氰比色法

VB5与溴化氰结合后可与对氨基苯乙酮（或其它芳香族胺）作用生成黄色化合物，因而可在420nm波长处测定光密度，求出VB5的含量。

（2）气相色谱法

烟酸分子具有羟基，不溶于有机溶剂，不能直接用气相色谱法进行测定，但烟酸经酯化转变成烟酸乙酯或N—2基烟酰胺之后，可以用气相色谱法进行分离测定。

（3）高效液相色谱法

利用酸水解法提取VB5，经高效液相色谱分离，测定。第12页，共37页，2023年，2月20日，星期一

4、维生素B6的测定

国标法为微生物法。

（1）荧光分析法

样品经硫酸加压水解，采用CGS树脂的柱层析分离，以氯化钾的磷酸缓冲液洗脱。洗脱液在二氧化锰和乙醛酸钠溶液存在下，可使VB6的混合物即吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺一次转化为吡哆醛。吡哆醛在氰化钾作用下生成强荧光物质—吡哆醛氰醇衍生物。在激发波长355nm，发射波长434nm处，测定其荧光强度，就可计算出样品中VB6的含量。第13页，共37页，2023年，2月20日，星期一

（2）气相色谱法

VB6与七氟丁基咪唑反应可生成挥发性的衍生物，该衍生物在气相色谱中可以很好地分离。最低检出限10ng。

气相色谱条件：电子捕获检测器；3%SE—52，固定相ChromosorbW—HPO

（3）液相色谱法

样品水解后上机测定。

C18柱

荧光检测器：激发波长290nm，发射波长395nm。第14页，共37页，2023年，2月20日，星期一

5、维生素B12的测定

（1）比色法

样品用浓硫酸和高氯酸钾消化后，样品中的钴与M—α—吡啶联腙生成钴的红色化合物，可以进行比色测定，再从钴的含量换算成VB12的含量。

注意：样品中存在游离钴离子将使测定结果偏高，可以预先用8—羟基奎宁—氯仿溶液提取，分离除去。

（2）原子吸收分光光度法

维生素B12的分子中含有钴离子，占VB12的4.35%，采用原子吸收分光光度法可以测定其钴含量，再换算成VB12的含量。第15页，共37页，2023年，2月20日，星期一

样品预处理：

样品用VB12提取液（无水磷酸氢二钠1.3g＋柠檬酸1.2g＋无水焦亚硫酸钠1.0g加水至100ml）提取，滤液中加入EDTA，用氨水调pH至7，再加入活性炭，振摇，用无灰滤纸过滤，VB12被吸附在活性炭上，将活性炭连同滤纸一起在600℃下灰化完全，用硝酸将残渣溶解，以原子吸收分光光度法测定钴的含量。

从钴换算为VB12的换算系数=22.99。第16页，共37页，2023年，2月20日，星期一GB\GBT5009.217-2008保健食品中维生素B12的测定.pdf第17页，共37页，2023年，2月20日，星期一GB\GBT5009.210-2008食品中泛酸的测定.pdf第18页，共37页，2023年，2月20日，星期一GB\GBT5009.211-2008食品中叶酸的测定.pdf第19页，共37页，2023年，2月20日，星期一文章\高效液相色谱法测定蔬菜中B族维生素.pdf第20页，共37页，2023年，2月20日，星期一（三）维生素C的测定

在食品中VC有三种存在形式：

还原型抗坏血酸（－2H，氧化）脱氢型抗坏血酸二酮古洛糖酸。

1、提取方法

食品中的维生素C通常采用草酸、草酸－醋酸、偏磷酸－醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用。草酸对维生素C有很好的稳定性能；偏磷酸能沉淀蛋白质，澄清提取液，适合于蛋白质含量较高的样品。第21页，共37页，2023年，2月20日，星期一2、还原型抗坏血酸的测定

（1）分光光度法

在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐B反应生成黄色的草酰肼-2-羟基丁酰内酯衍生物。在最大吸收波长420nm处测定吸光度，与标准系列比较定量。

非蛋白性样品在乙酸溶液中提取，过滤后上清液供测定；蛋白性样品需再加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，沉淀蛋白质。第22页，共37页，2023年，2月20日，星期一

（2）2,6—二氯靛酚滴定法

还原型抗坏血酸可以还原染料2,6—二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色，被还原后成无色溶液。在终点时，过量的未被还原的染料在酸性溶液中呈粉红色，因此，在滴定过程中当溶液从无色转变成微红色时，表示还原型抗坏血酸全部被氧化为脱氢抗坏血酸，此时即为滴定终点。第23页，共37页，2023年，2月20日，星期一3、总抗坏血酸的测定

（1）荧光法：

国标第一法。

样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成有荧光的喹喔啉衍生物，其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。

激发光波长338nm，发射波长420nm。第24页，共37页，2023年，2月20日，星期一

当食物中含有丙酮酸时，也与邻苯二胺反应生成一种荧光物质，干扰测定。这时加入硼酸。硼酸与脱氢抗坏血酸结合生成硼酸脱氢抗坏血酸螯合物，此螯合物不能与邻苯二胺反应生成荧光物质；而硼酸不与丙酮酸反应，丙酮酸仍可发生上述反应。因此，加入硼酸后测出的荧光值即为空白的荧光值。

注意事项：

试样用偏磷酸-乙酸溶液提取；

活性炭加入量要适量，量过多，对抗坏血酸有吸附作用，使结果偏低；

空白氧化液中加入硼酸溶液后需在4℃冰箱中放置2-3h，使反应完全，否则本底偏高。第25页，共37页，2023年，2月20日，星期一

（2）2,4—二硝基苯肼比色法：

国标第二法。

样品中VC用草酸提取，活性炭使提取液中还原型抗坏血酸氧化成为脱氢抗坏血酸，然后与2,4—二硝基苯肼作用生成红色的脎。在85％硫酸溶液的脱水作用下，可转变为桔红色的无水化合物—双-2,4二硝基苯。最大吸收波长500nm，吸光度与总抗坏血酸的总量成正比，进行定量分析。第26页，共37页，2023年，2月20日，星期一文章\猕猴桃中维生素C的高效液相色谱分析.pdf第27页，共37页，2023年，2月20日，星期一二、脂溶性维生素类的分析测定

（一）理化性质

1、溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。

2、耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，VE对酸稳定。VA、D对碱稳定，VE对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下也能经受碱的煮沸。

3、耐热性、耐氧化性：VA、D、E耐热性好；VA、E易氧化，光、热能促进氧化；VD不易被氧化。第28页，共37页，2023年，2月20日，星期一

根据上述性质，测定脂溶性维生素时，通常先用皂化法处理样品，水洗去除类脂物。然后用有机溶剂提取脂溶性维生素（不皂化物），浓缩后溶于适当的溶剂中测定。为了防止氧化，常加入抗氧化剂。对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。

操作在避光条件下进行。

第29页，共37页，2023年，2月20日，星期一

（二）维生素A的测定

1、比色法

国标第二法。

维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑作用，生成蓝色化合物，在波长620nm处有特异吸收。

适用于维生素A含量较高的样品。

该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差，比色测定必须在6s内完成，否则蓝色会迅速消退，造成极大误差。第30页，共37页，2023年，2月20日，星期一

2、高效液相色谱法

国标第一法。

（1）原理：

试样中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱C18反相柱将维生素A及维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。

内标物：苯并[e]芘标准液

流动相：甲醇＋水（98＋2）

紫外检测器：波长300nm

第31页，共37页，2023年，2月20日，星期一

（2）样品处理：

①皂化：准确称样于皂化瓶中——加无水乙醇，搅匀——加抗坏血酸（抗氧化剂），加苯并[e]芘标准液（内标物）——加氢氧化钾（1＋1）——于沸水浴回流30min，使皂化完全——立即放入冰水中冷却。

②提取：皂化物移入分液漏斗——加乙醚提取——弃去水层。

③洗涤：用水洗乙醚层，至水层不显碱性。

④浓缩：将乙醚提取液脱水（经无水硫酸钠过滤）后移入旋转蒸发器的球形蒸发瓶中——55℃水浴中减压蒸馏——蒸发瓶中剩余2mL乙醚时，取下蒸发瓶，用氮气吹干——加乙醇溶解提取物——离心，上清液供色谱分析。第32页，共37页，2023年，2月20日，星期一第33页，共37页，2023年，2月20日，星期一

（三）维生素E的测定

1、比色法

维生素E与FeCl3反应，Fe3+被还原成Fe2+，Fe2+可与—联氮苯发生颜色反应，呈红色，因此在520nm处测定吸光度，可定量测定样品中VE的含量。

2、GC法

3、HPLC法第34页，共37页，2023年，2月20日，星期一维生素E测定的GC分析条件

化合物检测器固定相检测波长