第六章花药与花粉培养

第六章花药与花粉培养第1页，共29页，2023年，2月20日，星期一第一节概述图8.1花药（A）和花粉（P）培养的雄核发育和单倍体植株的各种方式图解第2页，共29页，2023年，2月20日，星期一第二节小孢子的形成和花粉的发育途径一、小孢子的正常发育二、花药培养时花粉发育途径1营养细胞发育途径（A型）2生殖细胞发育途径3营养细胞和生殖细胞并进发育途径4花粉均等分裂途径第3页，共29页，2023年，2月20日，星期一一、小孢子的正常发育第一期:四分孢子形成期第二期:单核期特点：特化的细胞壁逐渐形成。可分为：单核早、中、晚（靠边）第三期：双核期第四期：三核期第4页，共29页，2023年，2月20日，星期一二、花药培养时花粉发育途径1、营养细胞发育途径（A型）花粉

生殖核（小）------不分裂或分裂几次后退化营养核（大）-----经多次分裂而形成多细胞团，并迅速增殖而突破花粉壁，细胞持续分裂形成类胚体或愈伤组织，最后形成单倍体植株常见的植物：烟草、大麦、光叶曼陀罗、小麦、小黑麦和辣椒第5页，共29页，2023年，2月20日，星期一2、生殖细胞发育途径只在天仙子中出现完全不再分裂只分裂有限几次即停止营养细胞生殖细胞多次分裂多细胞团发育愈伤组织胚状体单倍体植株第6页，共29页，2023年，2月20日，星期一3、营养细胞和生殖细胞并进发育途径营养细胞多次分裂大的多细胞团生殖细胞多次分裂小的多细胞团同时发育愈伤组织胚状体单倍体植株只见于南洋金花中DNA复制两种营养核发生融合发育2n、3n或4n胚状体有两种情况12第7页，共29页，2023年，2月20日，星期一4、花粉均等分裂途径这个途径在南洋金花中相当普遍生殖细胞多次分裂多细胞团发育愈伤组织胚状体单倍体植株营养细胞花粉均等分裂营养核生核核第8页，共29页，2023年，2月20日，星期一第三节花药培养概念：花药培养（antherculture）：指用无菌操作技术将成熟或未成熟的花药接种在人工培养基上，诱导花粉单性发育形成植株的过程。第9页，共29页，2023年，2月20日，星期一一、花药培养的一般操作程序1.培养基的选择2.材料选取3.材料预处理4.材料消毒5.接种6.脱分化培养7.再分化培养8.花粉植株移植9.染色体加倍第10页，共29页，2023年，2月20日，星期一1.培养基的选择NitschH、MS被广泛用于双子叶植物的花药培养。B5：被广泛用于十字花科及豆科植物的花药培养。禾谷类植物的花药培养，早期多采用Miller培养基、MS培养基、N6培养基和马铃薯2号培养基。

Sunderland(1984)设计了C17培养基，用于水稻、小麦、大麦、小黑麦、黑麦、玉米和甘蔗等禾谷类作物的花药培养。第11页，共29页，2023年，2月20日，星期一2.材料选取植物种减数分裂中期减数分裂晚前期四分体单核期双核期成熟期水稻小麦玉米油菜大麦番茄茄子辣椒拟南芥菜甘蓝苹果葡萄烟草小黑麦小黑麦×羊茅杨树00000000000000000000不同植物花药培养的合适花粉发育时期第12页，共29页，2023年，2月20日，星期一3.材料预处理低温：高温生长素其他方法处理常能提高愈伤组织和苗分化的频率。第13页，共29页，2023年，2月20日，星期一4.材料消毒取回的材料，在接种前进行表面灭菌，一般用70～75％酒精，将表面擦洗即可。第14页，共29页，2023年，2月20日，星期一5.接种在无菌接种室或超净工作台上进行接种操作，采用直径3cm的试管，每管接种花药30～60粒。必须注意：在操作过程中，不应使花药受到损伤，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体的愈伤组织。损伤的花药要淘汰。第15页，共29页，2023年，2月20日，星期一6.脱分化培养根据材料不同，选取适宜的基本培养基、适当的生长素比例和最适的温度进行培养，经10～30天可诱导愈伤组织形成。第16页，共29页，2023年，2月20日，星期一7.再分化培养愈伤组织增殖到1～3mm大小时，应及时进行再分化培养以获得花粉植株。要选择含适当激素水平的培养基进行培养，约经20～30天就能诱导苗的分化。第17页，共29页，2023年，2月20日，星期一8.花粉植株移植当花粉植株的根系生长良好时，就要及时进行炼苗并移至苗床或大田。试管中花粉植株的移植是一个由异养转变为自养的过程，必须细心管理，保持幼苗的水分平衡和促进新根的发生。第18页，共29页，2023年，2月20日，星期一9.染色体加倍人工方法：用0.02～0.4%秋水仙素处理植株，双子叶植物处理生长点或腋芽，禾本科植物在分蘖期处理。单倍体植株可以通过自发的核内有丝分裂产生的二倍体。第19页，共29页，2023年，2月20日，星期一第20页，共29页，2023年，2月20日，星期一二、花药培养的方法琼脂固体培养法在培养基中加入0.5～0.7%琼脂，使培养基呈半固体状态。加入的琼脂量因琼脂质量而定。琼脂浓度一般以花药有1/3浸入而又不沉没于琼脂中为宜。液体培养法液体培养的培养基厚约0.5cm,若能让花药漂浮在液面上,效果最好。加入聚蔗糖(Ficoll),可使花药不下沉而漂浮在液面上。第21页，共29页，2023年，2月20日，星期一第四节花粉培养

含义：花粉培养(pollenculture)是指把花粉从花药中剥离出来，在无菌的人工环境中，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养使其进一步生长发育的技术。优点：在于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是单倍体植株，不会因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成体细胞植株。花粉是研究细胞分化条件、胚胎发生和形态发生机制的较为理想的材料。建立花粉培养实验系统也可为深入开展细胞工程、遗传工程和分子生物学的研究提供技术基础。第22页，共29页，2023年，2月20日，星期一一、花粉培养的一般操作程序花粉培养与花药培养的一般操作程序基本相同。花粉培养在材料消毒后要将花粉从花药中分离出来，再进行接种，其基本操作程序可参照花药培养。第23页，共29页，2023年，2月20日，星期一二、花粉的分离方法自然散落法把花药从未开的花中在无菌条件下取出，直接插接在无菌培养基上，当花药自动裂开时，花粉散落在培养基上，移走花药，让花粉继续培养生长。如果是液体培养基，可接种大量花药，经1～2天，大量花粉散落入培养基中，经离心浓缩收集，再接种培养。机械挤压法优点：操作简便缺点：花粉中混杂有体细胞并且所得的悬浮液中花粉密度也不易控制。第24页，共29页，2023年，2月20日，星期一三、花粉培养的方法直接培养法从未经任何预培养或预处理的新鲜花药中分离花粉粒，直接接种到培养基中进行培养的方法为直接培养。预培养法将花药在基本培养基中预培养3～6天，然后取出花粉，经离心冲洗后，在液体培养基中进行培养，密度为105个/ml。培养三周后，可见到各个阶段的花粉胚；4～5周后，可发育成小植株。看护培养法先把植物的完整花药放在半固体琼脂培养基表面，然后在花药上覆盖一张滤纸小圆片，用移液管吸取0.5ml花粉悬浮液，密度是每毫升含有20个花粉粒，滴在滤纸圆片上，置于26℃下培养。条件培养法在合成培养基中加入失活的花药提取物，然后接入花粉进行培养。由于失活的花药提取物中含有促进花粉发育的物质，有利于花粉培养成功。添加花药提取物的浓度随植物的种类而异。哺养培养微室培养将花粉粒接种在盖玻片或载玻片制作的一个微室的环境中进行培养。第25页，共29页，2023年，2月20日，星期一四、影响花药和花粉培养的因素材料的基因型供体植株的生活环境个体发育的时期：开花早期的花药比开花后期的更易产生花粉植株离体花药预处理低温预处理：预处理温度一般最低为2℃，最高为14℃，处理时间短的仅6小时，长的达35天，高温处理其他处理：低温、高温、高渗、饱和水汽、离心磁场、Y射线、pH、CO2、ABA、丁酸钠、放线菌素D，甲基磺酸乙酯培养基成分基本培养基成分：主要是MS、N6，Blaydes(即Miller)，B5、Nitsch。植物激素生长素，如2,4-D、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）等，细胞分裂素如激动素（6-呋喃氨基嘌呤、KT、K2N）、6-BA（6-苄基氨基嘌呤）和玉米（ZT、ZEA）糖：在花药培养中，其蔗糖浓度一般以2～5%为宜。麦芽糖更佳。pH：当pH值达到5.8时，效果最好。第26页，共29页，2023年，2月20日，星期一不同浓度蔗糖对烟草花药出苗率的影响蔗糖（%）接种花药数出苗花药数出苗率019001711723.932532037.733642539.064791417.72第27页，共29页，2023年，2月20日，星期一第五节花药与花粉培养的应用及前景一、花药培养和花粉培养的应用首先，花药培养可用于常规育种从品种间杂交的杂种一代或二代、三代的花药可培育出纯合二倍体花粉植株，用于品种的选择和鉴定。在这种情况下常规育种所必需的多代自交的程序可以被省去，育种的时间也可大大缩短，这种方法也可以称为单倍体育种。其次，来源于花粉的纯合二倍体可以作为自交系用于异花传粉植物的