基因工程制药课件

第二章基因工程制药2.4基因工程菌生长代谢的特点一、比生长速率μ(h-1)细胞生长速率rX

：单位时间内细胞浓度的变化（g/L·h）。

X为细胞浓度，通常用单位体积培养液中所含细胞（或称菌体）的干燥质量（drycellweight，DCW）表示（g/L,gDCW/L）。培养过程中，细胞的生长速率与细胞浓度成正比。2g/L4g/L10g/L20g/L生长速率rX

：单位时间内细胞浓度的变化（g/L·h）

2g/L·h10g/L·h

1h-11h-11h2.5基因工程菌的稳定性一、质粒的不稳定性（1）分裂不稳定性工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌。

相关因素：质粒的丢失率（宿主菌、质粒特性和培养条件）含质粒菌与不含质粒菌的生长速度差异（2）结构不稳定

DNA从质粒上丢失、质粒上序列发生重排等。二、提高质粒稳定性的方法1.选择合适的宿主菌株2.选择合适的载体低拷贝数质粒丢失的频率较大含高拷贝数质粒的菌比生长速度明显低于不含质粒菌。3.加入抗生素二、提高质粒稳定性的方法4.分阶段培养表达水平越高，重组质粒越不稳定。

二阶段培养：第一阶段菌体生长第二阶段诱导表达5.控制培养条件

高比生长速率下质粒稳定性明显增加。培养基成分、温度等培养条件对质粒稳定性也有影响。6.固定化

固定化适用于分泌表达的蛋白，对非分泌表达蛋白难以大规模采用。3、连续培养（continuousculture）培养开始时为分批培养，培养至一定程度后，连续不断的补加新鲜培养基同时排出等量培养液。一定时间后，细胞浓度和培养基中各种物质浓度均保持不变。基因工程菌不稳定，很难连续培养。4、透析培养（dialysisculture）

通过透析除去乙酸。

E.coliHB101(pPAKS2)生产青霉素酰化酶提高11倍。二、基因工程菌的培养工艺1、培养基的影响

碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、果糖等。氮源、无机盐等其他成分。通过单因子实验、正交设计等方法优化培养基组成，提高蛋白表达水平。2、接种量的影响

接种量小，延迟期长，菌容易老化，不利于蛋白表达。较大的接种量延迟期短，适于蛋白表达。接种量一般为5~15％。3、温度的影响

温度对基因表达的调控机理很复杂，对不同蛋白，最佳的诱导表达温度不同。4、溶氧（dissolvedoxygen，DO）的影响

较高水平的DO（大于10~30％）的有利于蛋白表达，供氧不足，产生乙酸。加大搅拌、增加气流、提高氧分压、提高罐压。控制糖源的流加速度。

恒溶氧发酵：通过以上手段控制DO在一恒定值。5、pH的影响

流加酸、碱调节pH。pH一般控制在6.8~7.6，少数例外。6、诱导时机的影响

一般在对数生长期进行诱导表达。三、高密度发酵理论上计算大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度（干重）为400g/L，一般认为最高的发酵密度（干重）为200g/L。目前培养所达到的最高密度是175g/L。高密度发酵的成功关键是补料策略。

乙酸的积累是高密度培养生产重组蛋白质的一个主要问题是。

三、高密度发酵工艺上对策：在发酵工艺上常通过改变培养基组成（以甘油为初始碳源）降低培养温度限制性流加葡萄糖提高供氧能力（加强搅拌、提高氧分压、提高罐压）三、高密度发酵菌种上对策：阻断E.coli乙酸产生：敲除磷酸转乙酰酶基因（pta1）和乙酸激酶（ack）的基因；改变代谢流方法：导入丙酮酸脱羧酶基因pdc1和乙醇脱氢酶adh2，丙酮酸生成乙醇；限制葡萄糖摄取主要途径（磷酸转移系统），同时还需加强其他葡萄糖摄取途径；引入血红蛋白基因2.7基因工程药物的分离纯化二、建立分离纯化工艺需了解的因素1、起始物料的特点菌种类型、蛋白的表达部位、产物浓度等。2、目的产物特性（各种物理化学性质、稳定性）3、杂质的种类和性质4、产品质量的要求

准许存在的杂质种类和最低含量、纯度、比活等。三、细胞破碎物理方法

珠磨、高压匀浆、超声波破碎、匀浆、冻融、低渗裂解、研磨等化学方法有机溶剂（甲苯、丙酮等）、表面活性剂等。

生物方法酶法：溶菌酶、葡聚糖酶、溶壁酶等；自溶：一定pH和温度；一般采用加热法，自溶时间较长。

四、固液分离胞外蛋白：离心包含体：离心、低速离心胞内蛋白：去除细胞碎片高速离心、微滤（0.1～10um）、双水相萃取（PEG-Dextran、PEG-盐系统）、絮凝、膨胀床吸附

五、分离纯化方法

主要为各种层析方法：离子交换层析、凝胶过滤、疏水层析、亲和层析超滤六、非蛋白类杂质的去除DNA（离子交换、疏水层析等）热原（脂多糖，超滤、阴离子交换、疏水层析、多黏菌素B亲和层析）病毒（紫外线照射、40nm膜过滤）2.8、包含体的复性

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时通常会形成一种由目的蛋白构成的不溶的、无活性的蛋白聚集体即包含体（InclusionBody）

包含体内约90%的成分是蛋白质，目的蛋白占50％以上。一、包含体表达的优点表达量高密度高（1.2-1.4g/mL之间），容易分离抗蛋白酶对宿主毒性小二、包含体蛋白处理过程细胞破碎包涵体分离包涵体溶解目的产物的复性变性条件下纯化包涵体洗涤三、包含体的复性方法方法：1.稀释复性2.透析复性3.层析复性影响复性的操作参数：蛋白浓度、温度、pH、离子强度。提高蛋白复性率的策略：复性添加剂如PEG、表面活性剂分子伴侣常用半胱氨酸之间形成二硫键方法：1.空气氧化法在碱性条件下通空气，氧化时可以加入二价铜离子加快反应速度，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势，而且二硫键的氧化形成速度慢；2.氧化还原对重排体系常用氧化还原对有氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸，通过调整氧化还原两种物质的比例可以控制较精确的氧化还原电势，对二硫键反应进行控制，其二硫键形成速率快于空气氧化法。2.9基因工程药物的质量控制

生物材料、培养过程、纯化过程、产品的质量控制。

目标产品的质量控制：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性、一致性。1.生物活性测定活性、比活2.产品的鉴定（1）相对分子量

SDS、凝胶过滤，允许10%误差。

必要时采用质谱准确测定。（2）等电点

等电聚焦测定，等电点常不均一，每批测定结果应一致。（3）紫外吸收光谱

特征型吸收，每批一致（4）氨基酸序列测定

送检中试头三批产品，N端15个氨基酸序列，C端1～3个氨基酸残基。（5）氨基酸组成分析（6）免疫印迹（westernblot）（7）圆二色光谱（8）肽图一般用胰蛋白酶或CNBr裂解，再用RP-HPLC或SDS分析（9）二硫键分析3.蛋白纯度分析

必须采用非还原SDS和HPLC进行检定，其他检测方法包括CE（毛细管电泳）等。4.杂质检测（1）内毒素家兔法、鲎试剂法（2）宿主细胞蛋白免疫分析（3）宿主细胞残余DNA

核酸杂交，100pg/剂量（4）细菌、酵母、真菌、支原体、病毒微生物学方法（5）其他物质抗生素牛血清采用了抗体亲和层析，检测小鼠IgG含量。5.稳定性检测

在不同温度下保存，定期取样检测生物活性及其他特性的变化。6.一致性

各批次产品均符合标准规格。产品的保存：液态保存低温：-20℃、-80℃和液氮、短期4℃稳定的pH

高浓度加保护剂：糖类、脂类、蛋白类、还原剂（二硫苏糖醇）等固体保存含水量5%以下，4℃长期保存冷冻干燥

冻干过程中加保护剂：低分子化合物（葡萄糖、蔗糖等）、高分子物质（糊精、血清）